混播比例和刈割茬次对多花黑麦草+箭筈豌豆混播草地土壤细菌群落的影响

苟文龙, 李 平, 董臣飞, 李达旭, 白史且, 师尚礼*

(1.甘肃农业大学草业学院, 甘肃 兰州 730070; 2. 四川省草原科学研究院, 四川 成都 611731;3. 江苏省农业科学院畜牧研究所, 江苏 南京 210014)

土壤微生物是土壤生态系统中最为活跃的部分，参与90%左右的土壤反应过程，在土壤物质循环、能量流动及维持土壤生态系统多样性与稳定性方面发挥至关重要的作用[1]。其中土壤细菌种类繁多，数量最多，约占土壤微生物总量的70%～90%[2]，它直接或间接参与土壤生物化学循环，如分解与合成有机物质，土壤结构及腐殖质的形成等[3]。近年来人们开始关注和认识土壤微生物的生态功能，利用土壤微生物结构来衡量土壤健康质量的优劣。土壤细菌群落多样性是评价土壤质量的一项重要指标。土壤中细菌多样性越高，越有利于土壤恢复力和抗压力的提高[4]。植被类型和多样性、土壤水分、pH值、土壤类型及其理化性状、土地利用方式均显著影响微生物群落结构[5]，如Lauber等认为pH值是决定土壤微生物群落结构的主要因素[6]。

禾豆混播可以提高单位面积的产草量和蛋白质产量，提高土壤肥力，减少工业氮肥的施用，降低生产成本，减少环境污染，不仅能增加地上部的生物多样性，也可以增加地下部的土壤微生物多样性[7-8]。目前禾豆混播的研究主要集中在产量和品质[9]、竞争共存[10]、土壤养分[11]、根系形态[12]、施肥管理[13]、氮素固定与转移[14]等方面。关于禾豆混播草地土壤细菌群落结构的研究和报导较少，其中陆炳章研究多花黑麦草(LoliummultiflorumLamk.)与光叶紫花苕(ViciavillosaRoth)、箭筈豌豆(ViciasativaL.)的混播结果表明，混播区根际细菌、放线菌、真菌、固氮菌、纤维分解菌等均显著高于单播和休闲地[15]。王旭等研究燕麦(Avena sativa L.)和箭筈豌豆间行混播收获期根际土壤细菌数量是单作燕麦的1.1倍左右[16]。而混播比例和刈割茬次对禾豆混播草地土壤群落结构的影响方面的研究就更少。因此，本研究以多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤为研究对象，通过直接提取土壤细菌基因组总DNA，采用16S rDNA基因的通用引物PCR扩增及Illumina平台Miseq高通量测序技术对多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤中细菌群落结构与组成、物种丰富度和物种多样性进行研究，探讨混播比例和刈割茬次对多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤细菌群落的影响，为深入了解禾豆混播草地土壤细菌群落结构与组成变化、调节土壤环境质量和改善土壤管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样地描述与试验设计

1.1.1试验区自然概况 试验地位于四川省草原科学研究院大邑县韩场基地(103°45′ E，30°25′ N，海拔475 m)。试验区域属大陆性热带湿润季风气候，年平均气温15℃，最热月7月平均气温26.1℃，最冷月1月平均气温5.5℃，极端最低气温-4.8℃，极端最高气温35.1℃，年降水量1 300 mm。土壤为黄粘土，pH 6.74，有机质32.2 mg·kg-1，碱解氮185 mg·kg-1，有效磷41.8 mg·kg-1，速效钾127.3 mg·kg-1。全年日照时数1 033.8 h，年平均无霜期284 d。

1.1.2供试材料 长江2号多花黑麦草(LoliummultiflorumLamk‘Changjiang No. 2’)，纯净度98%，发芽率92%，由四川农业大学草学系提供；川北箭筈豌豆(ViciasativaL‘Chuanbei’)，纯净度95%，发芽率94.5%，由四川省农科院土肥所提供。

1.1.3试验设计 试验采用完全随机区组设计，共设5个处理，即100%多花黑麦草(R1)、75%多花黑麦草+25%箭筈豌豆(R2)、50%多花黑麦草+50%箭筈豌豆(R3)、25%多花黑麦草+75%箭筈豌豆(R4)和100%箭筈豌豆(R5)，每个处理3个重复。小区面积15 m2(3 m×5 m)，区组间隔0.8 m，小区间隔1 m。试验于2016年9月28日播种，采用撒播，撒播时，多花黑麦草和箭筈豌豆分开撒播。多花黑麦草单播播种量22.5 kg·hm-2，箭筈豌豆单播播种量75 kg·hm-2，混播组合中每个草种播种量是用混播组合中该草种的混播比例与单播播种量的乘积来表示。试验水肥采用统一管理，分别在翌年的1月4日(H1,多花黑麦草分蘖期/箭筈豌豆分枝期)、3月14日(H2,多花黑麦草拔节期/箭筈豌豆分枝期)、4月21日(H3,多花黑麦草孕穗期/箭筈豌豆现蕾期)、5月19 日(H4,多花黑麦草乳熟期/箭筈豌豆盛花期)4个时期进行刈割。

1.2 土壤取样和前期处理

每次刈割后，各小区以S形取样法在株丛附近用土钻采集0～20 cm土样，所有土壤样品采用北京富益联有限公司的便携式冰箱(FYL-YS-60L)带回实验室，储存在—80℃超低温冰箱后进行DNA提取和细菌群落分析。

1.3 DNA提取和 PCR扩增

参照Zeng等的方法进行DNA提取和PCR扩增[17]。使用CTAB / SDS方法提取土壤样品的总DNA。在1%琼脂糖凝胶上检测DNA浓度和纯度。使用无菌水将DNA稀释至1 ng·μL-1。选择引物515F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R(5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)扩增16S rRNA基因的V4高变区[18]。所有PCR反应均用Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)进行。将相同体积的1×上样缓冲液(含有SYB绿)与PCR产物混合，并在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。选择具有400 bp和450 bp之间的明亮主条带的样品用于进一步实验。将PCR产物以等密度比混合，并用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen，Germany)纯化。

1.4 文库建立及测序

使用TruSeq®DNA PCR-Free样品制备试剂盒(Illumina，USA)按照制造商的推荐产生测序文库，并添加指数代码。使用Qubit@2.0荧光计(Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100系统评估文库质量。最后，将文库在Illumina HiSeq2500平台上测序，并产生250 bp的配对末端读取数(reads)。

使用FLASH(V1.2.7)合并成对末端读取数(reads)[19]，然后在特定过滤条件下进行，以根据QIIME(V1.7.0)的质量控制过程获得高质量的有效序列(clean tags)[20]。使用UCHIME算法将序列(tags)与Gold数据库进行比较，以检测嵌合体(chimera)序列，然后去掉嵌合体序列[21]。

序列分析由Uparse软件(Uparse v7.0.1001)完成[22]。具有≥97%相似性的序列被归类为相同的操作分类单元(OTU，Operational Taxonomic Unit)。对于每个代表性序列，依据GreenGene数据库[23]，采用RDP 3算法(version 2.2)进行分类信息注释[24]。为了研究不同OTU的系统发育关系，以及不同样品(组)中优势种的差异，使用MUSCLE软件(版本3.8.31)进行多序列比对。

1.5 数据分析

用QIIME(Version 1.7.0)计算alpha多样性并用R软件(Version 2.15.3)显示。PC软件分析由R软件(Version 2.15.3)中的WGCNA软件包，stat软件包和ggplot2软件包显示。Beta多样性由QIIME软件(Version 1.7.0)计算。PC软件分析由R软件(Version 2.15.3)中的WGCNA软件包，stat软件包和ggplot2软件包显示。采用方差分析(ANOVA)评估土壤性质和细菌群落指数变化程度。

2 结果与分析

2.1 多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤细菌多样性

土壤样本细菌alpha多样性统计如表1所示。通过数据库比对注释，得到97 021个OTU,这些OTU具有>96%的序列相似性，R2H3具有最高的OTU(5 456)，R4H2具有最低的OTU(3 846)。土壤样品中细菌Shannon指数和Chao 1指数分别为8.82～10.56和6 697.67～7 963.69，表明禾豆混播草地土壤具有较高的细菌多样性。混播比例和刈割茬次对一年生禾豆混播草地土壤细菌香农指数和覆盖率无交互效应，混播比例对土壤alpha多样性指数无显著性影响，刈割茬次对土壤细菌OTU和Chao 1指数影响效果显著(P<0.05)。随着刈割茬次的增加，多花黑麦草单播R1的土壤细菌OTU和Chao 1指数呈增加趋势(P<0.05)；混播R2的土壤细菌OTU、Shannon指数和系统发育多样性指数呈先降低后增加趋势(P<0.05)；混播R3的土壤细菌OTU，Chao 1指数和系统发育多样性指数呈“S”型变化，Shannon指数呈线性增加(P<0.05)；混播R4和箭筈豌豆单播R5的土壤细菌OTU，Shannon指数，Chao1指数和系统发育多样性指数先降低后增加(P<0.05)。

2.2 多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤细菌群落组成

如图1所示，第1茬(H1)，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分别为824，620，548，597和975，共有OTU为1 909，第2茬(H2)，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分别为780，585，568，482和745，共有OTU为1 746；第3茬(H3)，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分别为618，610，864，553和523，共有OTU为2 602；第4茬(H4)，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分别为619，579，590，635和566，共有OTU为2 599；不同混播比例之间，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分别为949，732，791，708和762，共有的OTU为5 055；不同刈割茬次之间，H1，H2，H3和H4特有OTU分别为1 236，783，1 913和1 569，共有的OTU为5 073；随着禾豆混播比例或刈割茬次的增加，特有的OTU呈“Z”型变化；R5H1具有最多的OTU(975)，而R4H2具有最少的OTU(482)。

表1 土壤样本细菌Alpha多样性统计

注：H1:第1茬刈割，H2:第2茬刈割，H3:第3茬刈割，H4:第4茬刈割。下同

Note:H1:First cut,H2:Second cut,H3:Third cut,H4:Forth cut. The same as below

图1 多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤细菌OTU韦恩图

多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤细菌在门、目和属分类水平上的相对丰富度如图2所示。在门水平上的主要群体是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和疣微菌门(Verrucomicrobia)，其中变形菌门、酸杆菌门和放线菌门是土壤的优势细菌门，占整个细菌类群丰富度的59.1%～69.8%。H3土壤样品中变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门的丰富度最高(0.34，0.17，0.09)，放线菌门丰富度最低(0.11)，而H4土壤样品具有最高丰富度的硝化螺旋菌(0.05)；混播比例对门水平土壤细菌丰富度影响不显著。在目水平上，R3H1具有较高的假单胞菌目(Pseudomonadales)，相对丰富度为0.17；鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)随着刈割茬次增加，丰富度先增加后降低；红螺菌目(Rhodospirillales)、变形细菌目(Myxococcales)及Gaiellales丰富度随着刈割茬次增加，相对丰富度先降低后增加。在属水平上，芽单胞菌属(Gemmatimonas)和Gaiella随着禾豆混播中豆科牧草比例的增加，相对丰富度先增加后降低；随着刈割茬次的增加，芽单胞菌属和棘刺杆菌属(Sphingobacterium)呈降低趋势。

不同混播比例之间未发现具有统计学差异的细菌，不同茬次之间具有统计学差异的土壤细菌(图3)。H1具有显著性差异的土壤细菌为γ-变形菌纲(Gammaprobacteria)、假单胞菌目、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)和丙酸杆菌目(Propionibacteriales)。H2具有显著性差异的土壤细菌为嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、红杆菌目(Solirubrobacterales)、Gaiellales、芽单胞菌目(Gemmatimonadales)、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、未分类的芽单胞菌门(undentified-Gemmatimor)、浮霉菌门(Planctomycetales)、浮霉菌纲(Planctomycetacia)和浮霉菌科(Planctomycetaceae)。H3具有显著性差异的土壤细菌为β-变形菌纲(Betaprotebacteria)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria)、Subgroup-6和噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)。H4具有显著性差异的土壤细菌为未分类的放线菌纲(unidentified-Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、根瘤菌目(Rhizobiales)和红螺菌目。

图2 多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤细菌在门、目和属分类水平上的相对丰富度

图3 多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地不同刈割茬次之间的LEfSe分析

PCoA分析表明，在X轴和Y轴上分别能够解释不同样品处理之间差异的25.25%和17.61%(图4)。NMDS分析时，stress为0.127，能够有效解释不通样品的变异程度。PCoA和NMDS分析表明H3的细菌群落显著不同于H1，H2和H4。通过Annosim，MRPP和Adonis分析时(表2)，不同刈割茬次之间细菌多样性存在显著差异(P<0.05)。

3 讨论

南方是中国主要农业区，传统种植业由于工业氮肥的持续使用，导致大气氮沉积，土壤酸化和土壤微生物多样性降低。如中国南方化肥的大量使用加剧了土壤酸化(从1982年的6.5降至2012年的6.19)和耕地退化，导致土壤生态功能下降[25]。土壤微生物是土壤有机物循环的基础，其对生存环境改变的相应较迅速，能够有效及时地反映土壤环境的变化，是表征土壤健康的生物标准[26]。土壤类型、土壤理化性状、地上植被、季节更替、田间管理等影响土壤微生物的群落组成和结构。其中，豆科牧草的加入有可能提高一年生禾草生产系统的粗蛋白来源和维持土壤健康[27-28]。因此，探索四川农区一年生禾豆混播草地土壤的细菌群落特征，能够更好地了解这些细菌群落结构短期变化。

表2 采用3种非参数多变量方法(Anosim、MRPP和Adonis)分析不同刈割茬次对多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤细菌群落结构的影响

图4 多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤细菌群落结构

本研究主要利用高通量测序方法探讨了混播比例与刈割茬次对多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤细菌多样性的影响，其弥补了传统培养方法造成的信息丢失缺陷，可以更全面的反映真实环境中土壤微生物的群落结构和多样性差异。本研究中，总共获得97 021个OTU，测序的覆盖率大于96%，表明以上测序量能够很好地反映各个样品中细菌群落的结构和种类。所测定序列中主要的门包括变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、绿弯菌门和疣微菌门主要分布于土壤中，总相对丰富度>0.93。其中三个最丰富的土壤细菌群落是变形菌门(0.29～0.54)、放线菌门(0.08～0.36)和酸杆菌(0.08～0.18)，是多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地主要的细菌类群。这与多数有关农田土壤微生物群落组成所得研究结果是基本一致的。Ding等曾报道，变形菌门是农田土壤中的主要微生物(相对丰富度0.29～0.33)，其次是酸杆菌门(相对丰富度0.12～0.16)和放线菌门(相对丰富度0.09～0.11)[29]。此外，国内关于农田土壤细菌多样性的测序研究也表明，土壤中优势细菌门为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、厚壁菌门和芽单胞菌门[5]。

牧草栽培管理措施是影响土壤养分循环和改变微生物群落的重要因素[30]。禾豆混播，地上和地下空间分布格局合理，土壤理化性质改善，明显地促进了微生物活动，加速了有机物分解和养分积累[31]。植物群落多样性越丰富，凋落物和根系分泌物组成就越丰富，土壤微生物丰富度和多样性也就越高[32]。而本研究中，禾豆混播比例对土壤细菌多样性指标没有显著性影响。这可能是因为混播中多花黑麦草生长旺盛、竞争力强，箭筈豌豆生长较弱、耐刈性较差，无论混播比例大小，多花黑麦草始终在混播中占主导地位，使得混播比例对土壤细菌多样性在短期内未产生较大影响。这与Zhao等关于土壤微生物群落结构在豆科牧草单播、禾本科牧草单播及禾豆混播之间无显着差异的结果基本是一致的[33]。在温室环境中进行的生物修复实验也证实此类现象[34]。因此，多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地栽培管理过程中，箭筈豌豆增加了土壤微生物群落中特定物种丰富度。

本研究中，刈割茬次对土壤细菌多样性有显著性影响(P<0.05)，即随着刈割茬次的增加，Shannon指数呈线性增加。这说明了刈割引起牧草地上部发生变化后，牧草地上部的光合作用、呼吸作用、蒸腾作用以及光合作用产物的分配与转运以及根系的分泌等生理生态活动会发生相应的变化[35]，这些变化又会通过根系对土壤微生态环境产生一定的影响[36]。赛吉日呼分析了单播苜蓿、单播老芒麦、单播饲用燕麦和混播播种后土壤微生物多样性，结果表明，随着牧草生育期的推迟，细菌Alpha多样性指数呈上升趋势[37]。PCoA分析表明来自H3的土壤倾向于聚集在一起，表现出具有高度的相似性。由于多花黑麦草和箭筈豌豆混播第3茬刈割在4茬刈割中的单茬地上生物量最大[38]，推测认为地上生物量大，根系代谢作用加强，导致凋落物和根系分泌物多，在一定程度上改善了土壤微环境，使得细菌群落结构发生改变。此外，包括变形菌门、放线菌门和酸杆菌门在内的最主要的门在不同刈割时期间发生显著变化。δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)相对丰富度在H2样品中发生显著变化，而α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲相对丰富度在H3样品中发生显著变化。这些变化可能与植株长势的差异、根系活力的差异以及土壤本身和土壤中微生物基数的差异，引起土壤细菌相组成发生显著变化有关。

4 结论

在门分类水平上，变形菌门、酸杆菌门和放线菌门是多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地土壤的优势细菌门，占整个细菌类群丰富度的59.1%～69.8%，其中组合R3H4(50%多花黑麦草+50%箭筈豌豆混播第4茬刈割)的丰富度最大为69.8%。

在多花黑麦草和箭筈豌豆混播草地中，混播比例对土壤细菌多样性无显著性影响，刈割茬次显著影响土壤细菌OTU和Chao 1指数，引起土壤细菌群落结构和组成发生改变。