转Bar基因紫花苜蓿杂交组合的筛选与评价

周 仂，王英哲，徐 博，谭 晶，徐安凯*

(1. 吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118; 2. 吉林省农业科学院，吉林 长春 130118； )

紫花苜蓿(Medicagosativa)是起源于伊朗的一种产量高、营养品质优良的牧草，在我国各地均有分布[1]，在美国不足200年的栽培历史中，已成为第四大栽培作物，年经济收入超过100亿美元[2-5]。紫花苜蓿在我国已有2000多年的栽培历史，2019年中央1号文件提出“合理调整粮经饲结构，发展青贮玉米、苜蓿等优质饲草料生产”等目标任务，这为紫花苜蓿产业的发展提供了新的动力。

随着植物基因工程的迅速发展，植物转基因技术在紫花苜蓿遗传改良方面发挥着愈加关键的作用[6]。除草剂抗性一直是转基因作物的主要特征。如今转基因作物的全球种植面积已经接近2亿公顷，且其中抗除草剂作物的种植面积占80%[7]。目前，抗草铵膦基因被较早利用的抗性基因有2种，分别是Bar基因(Bialaphos resistance gene,Bar)和Pat基因(Phosphinothricin N-acetyltransferase gene,Pat)，这2种基因已经通过在水稻中的转化成功应用于商业化生产中[8]。陈倩楠等[9]通过农杆菌转化法将Bar基因稳定整合到谷子‘冀谷11’的基因组中。刘艳芝等[10]将Bar基因转入‘草原1号’苜蓿中，经筛选验证，证实得到的转基因植株对除草剂具有抗性。

传统的转基因作物通过回交进行育种，并且需要依靠分子标记的辅助。丁晓艳等[11]通过回交育种，将FBP7::iaaM基因导入短季棉品种‘晋棉11’，获得了相比亲本纤维产量提高的转基因回交后代JBC4。王文静等[12]应用分子跟踪检测技术，对4个T4代转TaEBP，GhDREB，GmDREB1，GmDREB3基因的小麦通过有限回交、滚动回交育种，获得抗旱相关转基因“矮败周麦18”小麦新种质。

利用雄性不育系育种，可以省去人工去雄的工作量，降低生产成本，提高经济效益。雄性不育系在普通杂交育种方面具有广泛的应用，可明显提高F1代杂交种子生产质量与产量，缩短育种周期[13]，但其在转基因作物育种上鲜有应用。

本试验以吉林省农科院的选育出的优良紫花苜蓿雄性不育系(MS-GN-1A)作为母本，筛选优异的抗除草剂转基因紫花苜蓿‘公农1号’为父本，配置杂交组合。对紫花苜蓿的杂交组合F1代分子水平以及抗除草剂特性等方面进行检测和相关分析，结合农艺学和品质性状筛选出抗除草剂的优异杂交组合，为转基因紫花苜蓿杂交种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验器材

1.1.1试验材料 植物材料：‘公农1号’紫花苜蓿(由吉林省农业科学院牧草生物技术育种研究室提供)，雄性不育系MS-GN-1A(由吉林省农业科学院草地所提供)。以普通‘公农1号’紫花苜蓿为父母本配置1个对照组合(CK)，以紫花苜蓿雄性不育系MS-GN-1A为母本，以11个农艺学性状有差异的抗除草剂紫花苜蓿株系为父本，配制11个杂交组合。组合配置编号见表1。

1.1.2试剂 采购由上海佑隆生物公司生产，编号为AS-013-LS的PAT/Bar转基因速测试纸；采购由北京康为世纪生物公司生产，编号为EG101-2的DNA提取试剂盒。

1.1.3试验地基本情况 试验地位于吉林省西部公主岭市(东经124°02′～125°18′，北纬43°11′～44°09)吉林省农科院畜牧分院院内。该地土壤为退化黑钙土，肥力中等，该地主要有龙葵(Solanumnigrum)、苍耳(Xanthiumsibiricum)、小蓟(Cirsiumsetosum)、铁苋菜(Acalyphaaustralis)等多种杂草。F1代杂交种种于吉林省农科院农业生物研究所的温室内。

表1 试验材料

1.2 试验方法

1.2.1杂交F1代抗除草剂特性的检测与筛选 在杂交F1代紫花苜蓿进入2～3叶期时用Bar试纸条对杂交后代进行初步筛选，得到Bar试纸条检测到的阳性紫花苜蓿叶片，然后根据试剂盒提示提取基因组DNA，检测所提取的DNA质量。以Bar基因序列作为特异引物用PCR仪(型号A37834)进行PCR扩增，扩增程序为94℃ 预变性7 min；94℃ 变性30 s，56℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，30个循环；72℃ 延伸4 min；4℃ 保存。反应产物在1.5%琼脂糖凝胶100 V电压下电泳约2 h，在凝胶成像仪上拍照并保存。Bar基因引物设计为：F:5′ATGAGCCCAGAACGACGCCC3′，R:5′CAGAT CTCGGTGACGGGCAGGAC3′。

1.2.2杂交组合产量和品质性状的测定 在初花期，对紫花苜蓿各个杂交组合F1代的株高和分枝数进行测量。将各杂交组合的后代全部留茬5 cm进行刈割。每组合杂交F1中随机挑取10株，进行鲜重的测定，随后放入温度为105℃的烘箱杀青15 min，再放入65℃的烘箱烘干至恒重，测定并记录茎、叶干重，计算茎叶比。

茎叶比(stem/leaf,S/L)=茎干重/叶干重

以索氏提取法(参考GB/T6433-2006)测定粗脂肪；以凯氏定氮法(参考GB/T6432-1994)测定粗蛋白；以酸碱洗涤重量法测定粗纤维(参考GB/T6434-1994)含量。

1.2.3灰色关联度分析方法 用X表示12个杂交组合，用K表示农艺学性状，以分枝、株高、干重、鲜重、叶茎比、粗纤维、粗脂肪和粗蛋白等8项性状中的最大值作为参考数列，记为X0= {X0(1)，X0(2)，X0(3)，……X0(n)}；各杂交组合X在各农艺学性状k处的值构成比较数列Xi，Xi={Xi(1)，Xi(2)，Xi(3)，……Xi(n)}，其中i=1，2，3，……N，N指的是组合数目，n为性状数目，分别为 12 和 8。具体公式如下：

关联系数：

(1.1)

等权关联度：

(1.2)

权重系数：

(1.3)

加权关联度：

(1.4)

其中|X0(k)-Xi(k)|表示绝对差值△i(k)，minimink|X0(k)-Xi(k)|最小绝对差，maximaxk|X0(k)-Xi(k)|表示最大绝对差。ρ代表绝对分辨系数，一般在[0，1]，本文取ρ=0.5。

1.2.4数据分析 采用Exce1 2003进行基础数据的记录与统计，用SPSS 22.0统计分析软件进行方差分析和相关性分析，其中均值的差异显著性和多重比较分别采用ANOVA和Duncan法分析，灰色关联度分析采用灰色关联度公式与Excel 2003相结合来完成，各参数全部采用均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 杂交后代的Bar试纸条检测

使用Bar试纸条对杂交后代紫花苜蓿中是否有Bar基因进行检测。经过Bar试纸条快速鉴定得出转Bar基因抗除草剂的紫花苜蓿，部分检测结果如图1所示：编号1，2，5，8有2条带出现，表明是转Bar基因抗除草剂紫花苜蓿阳性植株；编号3，4，6，7，9，10有1条带出现，表明是转Bar基因抗除草剂紫花苜蓿阴性植株。

图1 试纸条检测结果

2.2 杂交后代的PCR检测

以质粒为阳性对照，非转基因苜蓿为阴性对照，对Bar试纸条检测到的阳性苜蓿叶片提取基因组DNA，并以Bar基因序列作为特异引物进行PCR扩增。PCR检测后，部分检测结果如图2所示：在11份F1代材料中都发现了特异性片段，说明配置转基因紫花苜蓿杂交组合的可行性。

图2 杂交后代的PCR鉴定图

2.3 F1代农艺学性状的分析

将筛选得到的具有草铵膦抗性的杂交后代进行农艺学性状(产量和品质性状)分析，如图3所示，组合1为对照组(CK)，株高最高的组合是4，之后依次是组合5、组合12、组合3，株高最低的组合是9，其次是组合6，最高组合比最低组合株高高出23.67 cm。组合3、组合4、组合5、组合7、组合8、组合11和组合12表现较好，株高均高于对照组合，其中组合4显著高于对照组合(P<0.05)。

图3 12个苜蓿杂交组合株高性状的比较

如图4所示，单株分枝数最多的组合为4，其次是组合3，最低的组合是9，最高组合比最低组合分枝数高出达32个分枝。组合3、组合4、组合5、组合7和组合8表现较好，单株分枝数均高于对照组合，其中组合4显著高于对照组合(P<0.05)。

图4 12个苜蓿杂交组合分枝数的比较

如图5所示，干草产量最高的是组合4，之后是组合3和组合1，干草产量最低的是组合9，最高组合比最低组合的干重高出0.44 kg。组合3、组合4、组合5、组合7和组合8表现较好，干草产量均高于对照组合，其中组合4显著高于对照组合(P<0.05)。

如图6所示，鲜草产量最高的组合是4，其次是组合3、组合5和组合8，鲜草产量最低的组合是9，其次是组合12，最高组合比最低组合的鲜重高出0.68 kg。组合3、组合4、组合5、组合7和组合8表现较好，鲜草产量均高于对照组合，其中组合4显著高于对照组合(P<0.05)。

图5 12个苜蓿杂交组合干重的比较

图6 12个苜蓿杂交组合鲜重的比较

如图7所示，叶茎比最高的组合是4，最低的是组合2，各组合叶茎比从大到小依次是：组合4>组合5>组合3>组合8>组合12>组合7>组合1>组合11>组合10>组合6>组合9>组合2。组合3、组合4、组合5、组合7、组合8和组合12表现较好，叶茎比均高于对照组合。

图7 12个苜蓿杂交组合叶茎比的比较

如图8所示，粗蛋白最高的是组合5，最低的是组合6，各组合粗蛋白百分比从大到小依次是：组合5>组合3>组合4>组合12>组合8>组合7>组合1>组合10>组合11>组合2>组合9>组合6。组合3、组合4、组合5、组合7、组合8和组合12表现较好，粗蛋白百分比均高于对照组合，其中组合3、组合4、组合5、组合8和组合12显著高于对照组合(P<0.05)。

图8 12个苜蓿杂交组合粗蛋白的比较

如图9所示，粗脂肪最高的是组合8，最低的是组合9，各组合粗脂肪百分比从大到小依次是：组合8>组合5>组合4>组合3>组合7>组合12>组合1>组合11>组合2>组合6>组合10>组合9。组合3、组合4、组合5、组合7、组合8和组合12表现较好，粗脂肪百分比均高于对照组合，其中组合8显著高于对照组合(P<0.05)。

如图10所示，粗纤维百分比最高的组合是9，最低的是组合8，各组合粗纤维百分比从大到小依次是：组合9>组合10>组合6>组合2>组合11>组合1>组合12>组合7>组合3>组合4>组合5>组合8，粗纤维含量的变化规律与粗蛋白含量相反。组合3、组合4、组合5、组合7、组合8和组合12表现较好，粗纤维百分比均低于对照组合，其中组合3，组合4，组合5，组合8显著低于对照组合(P<0.05)。

图9 12个苜蓿杂交组合粗脂肪的比较

图10 12个苜蓿杂交组合粗纤维百分比的比较

2.4 杂交后代农艺学性状的灰色关联度分析

2.4.1原始数据的标准化处理 本试验包括的8项指标分别为：株高、分枝数、鲜重、干重、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维和叶茎比。各杂交组合的等权和加权关联系数值，如表2，3所示。

表2 各杂交组合的等权关联系数值

表3 各杂交组合的加权关联系数值

2.4.2各杂交组合的关联度分析 由表4可知，加权关联度和等权关联度的各项指标的排列顺序基本一致，但个别几项有细小出入，最后对各个指标的等权关联度结果进行由大到小的顺序排列：γ4>γ8>γ5>γ3>γ11>γ12>γ7>γ1>γ10>γ6>γ2>γ9，加权关联度结果进行由大到小的顺序排列：γ4>γ5>γ3>γ8>γ11>γ12>γ7>γ1>γ10>γ2>γ9>γ6，优势组合除组合3、组合5和组合8，劣势组合除组合2、组合6和组合9在加权和等权关联度分析位次中有些许差异，基本上等权关联度和加权关联度呈正相关的关系，优势组合和劣势组合两种关联度法表现基本一致。优势组合包括组合3，4，5，7，8，11，12，各种性状综合表现突出，综合性状高于对照组合；劣势组合包括组合2，6，9，10，各种性状综合表现较差，综合性状低于对照组合。

表4 各杂交组合的关联度及排序

3 讨论

3.1 紫花苜蓿杂交后代抗性分析

抗除草剂育种是最早开展和应用的转基因育种，由于紫花苜蓿本身组织培养再生性差，重复性低等原因，从而造成转化率低、遗传或表达不稳定等问题。因此，利用转基因工程技术手段来改良紫花苜蓿的遗传特性受到很大限制。如何利用好现有的紫花苜蓿转基因材料，培育出高产、优质且抗除草剂的苜蓿品种是本试验主要研究的问题。

本试验利用抗除草剂基因紫花苜蓿和雄性不育系紫花苜蓿进行杂交，使转基因技术与传统育种方法有效结合，发挥各自优势，加快和完善转基因目标性状导入紫花苜蓿的进程。国内外研究表明外源基因在受体作物内的遗传表达很不稳定，易出现基因沉默现象[14-15]。抗除草剂转基因作物的目的基因遗传表现复杂，部分转基因作物自交后代表现3∶1分离规律，与非转基因亲本杂交后代表现1∶1分离规律，但也有一部分除草剂转基因作物的表现不符合孟德尔分离规律[16]。本试验以转Bar基因紫花苜蓿为父本，雄性不育系紫花苜蓿为母本，进行人工杂交。对杂交组合F1代进行抗性检测，发现均有特异性条带出现，证明这些后代中已经存在抗除草剂基因。孟庆忠[17]采用农达41%水剂作为杀雄剂与转EPSPS基因的棉花进行杂交棉制种，棉花杂交种纯度不低于96%。本试验研究结果与其相似，获得的F1代纯度在98%以上。

3.2 紫花苜蓿杂交后代产量及品质性状的分析

苜蓿雄性不育系的选育及其利用已成为当前苜蓿生产中的热点，一旦杂种优势获得显著增产优质的效果，就可以大幅度提升该品种的市场竞争力[18]。吴永敷等[19]研究提出利用苜蓿雄性不育是获得杂种优势以得到高产优质抗逆的苜蓿品种的有效途径。Brummer[20]指出雄性不育系的选育是苜蓿杂种优势利用的基础，利用雄性不育系和常规品种杂交获得的F1代能够有效避免自交衰退。特木尔布和等[21]以MS-4配置40个杂交组合，得到杂交F1代的产量与对照相比平均增产25.2%。本研究结果与其相似，本试验中杂交组合3、组合4、组合5、组合7、组合8的F1代鲜草产量和干草产量均高于组合1(CK)，初步说明这几个杂交组合得到的后代在产量方面优于常规品种的杂交后代。

粗蛋白含量是划分紫花苜蓿等级的重要标准依据。一般来说优质的紫花苜蓿干草中粗蛋白含量大于18%[22]。粗脂肪是提供能量的主要物质，其重要性仅次于粗蛋白，其含量影响苜蓿的适口性。本试验研究发现，杂交组合3、组合4、组合5、组合7、组合8、组合12的F1代中粗蛋白和粗脂肪含量均高于常规品种的杂交后代(CK)，且粗蛋白含量均在18%以上，说明本试验选取的常规材料‘公农1号’紫花苜蓿为优质苜蓿，以上6个杂交组合在品质方面体现出杂种优势。根据2006年我国颁布的牧草草产品标准[23]指标规定，试验中杂交组合5为一级(粗蛋白质含量：20%～22%)牧草、杂交组合3、组合4、组合7、组合8、组合12为二级(粗蛋白质含量：18%～20%)牧草。

研究发现，杂交组合2、组合6、组合9、组合10、组合11的F1代的产量与品质均低于对照，未获得杂种优势，可能与亲本的性状有关，尤其是转基因材料，亲本的性能比常规品种稍弱一些。

3.3 紫花苜蓿杂交后代产量、品质相关性分析研究

产量是衡量植物生产性能和经济性能的重要指标[24]，因此，高产育种对紫花苜蓿尤为重要。紫花苜蓿产量是受多基因控制的数量性状，遗传和环境对产量影响较大，主要由单株株高、分枝数等多个性状与环境互作的结果[25]。海棠[26]认为产量大小是产量各构成因子平衡的结果，产量的高低取决于各因子间能够达到最佳平衡状态。以往对苜蓿产量的研究普遍认为，株高与干草产量、鲜草产量呈显著或极显著正相关。本试验通过11个杂交组合的产量因子分析研究表明，鲜草产量、干草产量均与株高和分枝数呈极显著正相关，说明株高与分枝数对苜蓿产量优势的形成非常重要，这与已有的研究[27]结果基本一致。赵松义等[28]认为优良的烟草杂种F1代，不仅产量具有超亲表现，农艺性状与烟叶产量优势的形成也密切相关，本研究结果与其相似。

3.4 F1代产量和品质的灰色关联度分析与评价

评价牧草的好坏的因子很多，仅以单一性状的方差分析作为评价标准在一定程度上有失全面或无所侧重[29]。邓聚龙[30]的灰色关联分析法中，等权关联度可反映草种间差异大小，即关联度越大的因素，相似度越高[31]。加权关联系数可真实反应出供试材料与最优指标的差异，即关联度越大，该材料与最优指标越接近，且相关研究证明，加权关联度更能准确反应供试材料的优劣[32]。

本试验对12个杂交组合的产量及品质性状进行灰色关联度分析，结果表明组合4的等权关联度与加权关联度均排名第一，可能与该组合草产量大、粗蛋白和粗脂肪含量高有重要关系。本试验结果表示，组合3，5，8，11，12的产量与品质性状指标相对较高，与参考材料有较大的相似度，使综合排名相对靠前，均在组合1(CK)之上，说明以上的杂交组合后代表现出不同程度的杂种优势，各指标性状均优于常规品种。由此可以看出，株高、分枝数、干草产量、鲜草产量、茎叶比对紫花苜蓿综合生产性能最大。贾瑞等[33]对不同紫花苜蓿杂交组合F1代的生物学特性的研究表示紫花苜蓿的选育过程中应将单株分枝数、干草产量、粗蛋白粗脂肪作为主要考虑因子，本试验结果与其不完全一致，这可能由于试验选择的杂交组合亲本品种不同，前者选用的杂交亲本多为国外品种，本试验则是选用国内东北地区的当家品种，两者亲本的遗传差异较大，另外也与栽培环境等条件不同有关。

3.5 三系配套技术在转基因紫花苜蓿育种中的应用

农业多样化对牧草产业的发展有着积极而又深远的影响[34]。我国在应用生物技术进行牧草遗传改良方面已经取得了许多成就[35]。王木月等[36]通过回交转育的手段，把抗除草剂基因Bar导入到多个籼稻(OryzasativaL.)品种中，并选育出不同基因组合的籼型转基因水稻株系。本试验以优良紫花苜蓿雄性不育系作为母本、优异的抗除草剂转基因紫花苜蓿公农1号为父本，配置杂交组合，得到具有抗除草剂特性的杂交组合F1代。

根据已有研究[37-38]，转基因作物的育种方法主要是集中在以分子标记为辅助的回交育种法，但是转基因作物与现有且相应的雄性不育系进行杂交育种的研究鲜有报道，在抗除草剂转基因紫花苜蓿中尚未见相关研究。使用雄性不育系来组配杂交种，可免去人工去雄的繁琐问题，简化了杂交育种的进程，提高了杂交种种子产量和制种效率，并使杂交种的产量和质量得到保证[39]。本试验将转基因技术的研究和应用与现有的紫花苜蓿苜蓿育种技术结合，通过杂交的方式，抗除草剂紫花苜蓿的转基因特性可以稳定遗传到F1代。这样不仅可以缩短育种周期，节省资源，而且目标性状也能得到稳定统一的遗传，抗除草剂转基因苜蓿也可以更加高效稳定的参与到现代的农业生产方式中。在此基础上，本试验针对抗除草剂转基因紫花苜蓿F1代的产量和品质性状，采用灰色关联度的方法进行评价和筛选，试验结果得到7组优秀的杂交组合。

4 结论

本试验通过抗除草剂紫花苜蓿与非转基因雄性不育紫花苜蓿杂交后代分析研究，发现抗除草剂Bar基因可稳定遗传给后代，说明Bar可以通过杂交转育的方式转入其他非转基因紫花苜蓿中。

相关性分析结果表明，紫花苜蓿鲜草产量、干草产量均与株高和分枝数呈极显著正相关。灰色关联度分析表明，株高、分枝数、干草产量、鲜草产量、茎叶比对紫花苜蓿综合生产性能最大。

通过综合性能指标评定，组合4为最佳杂交组合，其次，组合3，5，7，8，11，12也表现出不同程度的杂种优势，均可作为配置杂交组合储备的材料。