毛兰素通过MAPK途径抑制葡萄膜黑色素瘤增殖并诱导凋亡

查桂平　汪卓琼

[摘要] 目的 研究毛兰素对葡萄膜黑色素瘤细胞株增殖和凋亡的影响，以及探索潜在的信号通路。 方法 采用MTT比色法检测毛兰素对MUM-2B和C918葡萄膜黑色素瘤细胞株增殖活力的影响，DAPI染色结合AnnexinV/PI 双染后流式细胞分析检测葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡率，免疫印迹分析细胞增殖相关蛋白如p21、MAPK及其磷酸化形式，凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP等的表达量。 结果 毛兰素对C918、MUM-2B葡萄膜黑色素瘤细胞均存在不同程度的抑制作用。当浓度达到25 μmol/L时，MUM-2B 的抑制率达到（79.92±2.79）%，C918的抑制率在（84.60±0.81）%。DAPI染色可見细胞数量随毛兰素浓度增加而逐渐减少，而且存在细胞凋亡现象。随着毛兰素作用浓度的增大，G2/M期细胞的比例逐渐增加，早期和晚期凋亡细胞比例增加。在毛兰素处理后，p38 MAPK蛋白表达在MUM-2B中较为显著的下调，PARP总蛋白水平有显著下调（P<0.05），p38 MAPK总蛋白有一定程度的下调，而p21、PARP活化形式（cl-PARP）和Caspase-3的活化形式（cl-Caspase3）显著上调（P<0.05）。 结论 毛兰素能够有效抑制葡萄膜黑色素瘤细胞C918、MUM-2B、增殖，阻滞细胞周期，促进葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡，且其作用效果呈现出一定范围内的剂量依赖性。其作用机制与上调p21表达，抑制p38 MAPK表达有关，后者可削弱MAPK信号通路活化，并可活化细胞凋亡途径关键蛋白Caspase-3诱导凋亡。

[关键词] 毛兰素;p21;MAPK途径;葡萄膜黑色素瘤;细胞凋亡

[中图分类号] R739.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）22-0031-04

[Abstract] Objective To study the effects of erianin on proliferation and apoptosis of uveal melanoma cell lines and to explore potential signaling pathways. Methods MTT colorimetric assay was used to detect the effect of erianin on the proliferation of MUM-2B and C918 strains of uveal melanoma cell lines. After DAPI staining combined with AnnexinV/PI double staining， apoptotic rate of uveal melanoma cells was analyzed and detected by flow cytometry analysis. Western blot analysis was used to analyze cell proliferation-related proteins such as p21， MAPK and its phosphorylated form， expression amount of apoptosis-related proteins such as Caspase-3 and PARP. Results Erianin had different inhibitory effects on C918 and MUM-2B of uveal melanoma cells. When the concentration reached 25 μmol/L， the inhibition rate of MUM-2B was up to（79.92±2.79）%， and the inhibition rate of C918 was about（84.60±0.81）%. The number of cells visible in DAPI staining was decreased with the increase of the concentration of erianin， and there was apoptosis. As the concentration of erianin increased， the proportion of G2/M phase cells increased gradually， and the proportion of early and late apoptotic cells increased. After the treatment with erianin， among the two strains of cells， the expression of p38 MAPK protein was significantly down-regulated in MUM-2B， and the total protein level of PARP was significantly down-regulated （P<0.05）. The total protein of p38 MAPK was down-regulated to a certain extent， while p21， PARP-activated form （cl-PARP） and Caspase-3 activated form （cl-Caspase3） were significantly up-regulated（P<0.05）. Conclusion Erianin can effectively inhibit the proliferation of uveal melanoma cells C918， MUM-2B， arrest cell cycle， promote the apoptosis of uveal melanoma cells， and its effect is dose-dependent within a certain range. Its mechanism of action is related to up-regulation of p21 expression and inhibition of p38 MAPK expression. The latter can attenuate the activation of MAPK signaling pathway and activate the key protein Caspase-3 in the apoptosis pathway to induce apoptosis.

[Key words] Erianin; p21; MAPK pathways; Uveal melanoma; Apoptosis

眼部黑色素瘤包括葡萄膜黑色素瘤（Uveal melano-ma，UM）与结膜黑色素瘤（Choroidal melanoma，CM）[1]，其中UM是成人发生率最高的眼内恶性肿瘤，起源于葡萄膜层，恶性程度高，极易发生早期转移，预后差，死亡率高，严重威胁患者视力与生命。CM起病较为隐匿，早期不影响视力，发现时常有扩散转移，严重影响患者生命安全。因此，研究眼部黑色素瘤发生机制，对探寻眼部黑色素瘤早期诊断和治疗新靶点，提高治疗有效性，降低眼球摘除率及转移率，提高患者视觉预后及生存时间，具有十分重要的临床指导和科学意义。目前，针对该肿瘤的治疗主要为手术和放化疗等非病因治疗，缺乏针对其病因的治疗手段。

从天然植物中获得生物活性的天然产物是先导化合物发现的重要途径，统计1981～2002年20年来美国FDA批准的抗肿瘤药物发现，有74%是来自于天然产物或者通过其衍生物得到，比较典型的如紫杉醇、鬼臼毒素、喜树碱等。石斛是传统中药，为兰科多年生草本植物。国内外学者对石斛属植物进行了大量的药理学研究。研究表明石斛具有抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管以及抗血小板凝集等多种效能，特别是其抗肿瘤活性日益受到广泛关注[2]。有研究表明石斛能够通过下调ERK通路从而抑制肺癌细胞的增殖，另一方面，还能够促进肺癌细胞对失巢凋亡的敏感性[3]。在其他肿瘤中，石斛及其从中提取的活性物质表现出促癌细胞凋亡以及转移的现象，包括前列腺癌[4]、白血病[5]、乳腺癌[6]、骨肉瘤[7]等。毛兰素是石斛的活性化合物之一，属联苄类化合物，化学名为2-甲氧基-5-[2-（3，4，5-三甲氧基-苯基）-乙基]-苯酚，已有研究表明该化合物具有抗肿瘤活性，并可抑制视网膜血管新生[8]，但对其具体的分子机制及药物靶标却未能明确。另一方面，毛兰素对人葡萄膜黑色素瘤细胞的抗癌活性也鲜有报道。因此，本文旨在通过体外研究毛兰素对葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡与周期的影响，并探讨其可能的抗癌分子机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞和抗体

人葡萄膜黑色素瘤细胞株MUM-2B及C918均购自浙江如耀生物科技有限公司，FBS及RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司;细胞培养用PBS与双抗购自北京索莱宝生物科技有限公司;细胞培养所需耗材均购自美国Coring公司;MTT购自美国Amresco公司;DAPI染料购自Invitrogen公司;Annexin-FITC/PI流式检测试剂盒购自美国BD公司;免疫印迹所用抗体均购自CST公司，抗人Caspase-3抗体（货号9662，稀释比1∶1000），cleaved Caspase-3抗体（货号9664，稀释比1∶1000），PARP抗体（货号9542，稀释比1∶1000），以及cleaved-PARP抗体（货号9541，稀释比1∶1000），p38 MAPK抗体（货号8690，稀释比1∶1000），GAPDH（货号AB-P-R001，稀释比1∶1000）及HRP偶联的羊抗兔/鼠IgG等抗体购自Cell Signaling Technology公司，稀释比例为1∶1000（二抗1∶3000），流式检测周期与凋亡试剂盒购自美国BD公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 MTT法检测细胞增殖

采用MTT比色法检测毛兰素对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响。将细胞制成单细胞悬液接种于96孔培养板，培养24 h后加毛兰素（以加等量不含药培养基为对照组），孵育48 h，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）15 μL，孵育4 h后小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，检测波长562 nm，参比波长630 nm，测定吸光值，以不加药的培养基作为对照，计算毛兰素对葡萄膜黑色素瘤细胞的抑制率。

1.3 细胞核形态检测（DAPI染色）

C918和MUM-2B细胞铺板到10 cm，dish中，事先已放入入已灭菌的干净的盖玻片，做细胞爬片，用毛兰素处理24 h后，分别取出盖玻片置于6 cm dish中，PBS洗涤1～2遍，加入1 mL甲醇固定30 s，弃掉甲醇后，加入DAPI染液使其工作浓度为1 μg/mL，染色2～3 min，棄去DAPI染色液，加入适量PBS，洗3遍，立即置于荧光显微镜下观察细胞凋亡形态特征，激发波长为360～400 nm。

1.4 细胞凋亡检测

采用Annexin-FITC/PI流式检测试剂盒检测毛兰素对葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡的影响。将MUM-2B和C918细胞分组加毛兰素处理24 h后，胰酶消化，计数，取5×106 cells于1.5 mLEP管中，2000 rpm离心5 min，弃上清后加入预冷的PBS，2000 rpm离心5 min，弃上清，加入300 μL 1×BD Buffer重悬细胞，避光加入5 μL FITC，室温避光15 min，后加入5 μL PI，室温避光8 min，最后加入200 μL 1×BD Buffer混匀，上流式细胞仪中检测。

1.5 Western-blotting分析

收集毛兰素及阴性对照组处理24 h 后的C918和MUM-2B细胞，弃去培养基，预冷PBS洗涤2遍，加入150 μL 2×loading buffer裂解细胞至细胞呈黏稠状，1 mL注射器吹打使DNA断裂，随后于100℃处理10 min。总蛋白经10% SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上，加入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，加入一抗，4℃ 孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜 3 次后，通过 ECL 试剂盒进行显影检测。Image J分析条带灰度值，以GAPDH为内参计算蛋白表达的相对含量。

1.6 统计学方法

所有数据均以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较用t检验，多组间差异采用One-way ANOVA和Newman-Keuls-test多重比较t检验分析。双侧P<0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 毛兰素对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响

选择2株不同的葡萄膜黑色素瘤细胞，分别在3.125、6.250、12.500、25.000 μmol/L毛兰素作用48 h后，进行MTT测试，考察毛兰素对细胞增殖的影响，见表1。毛兰素对2株葡萄膜黑色素瘤细胞有不同程度的抑制，25 μmol/L毛兰素作用下MUM-2B抑制率达到（79.92±2.79）%，相同浓度下C918的抑制率（84.60±0.81）%。在一定浓度范围内，毛兰素对2株葡萄膜黑色素瘤细胞的抑制率随浓度增加而提高，两组抑制率比较发现，毛兰素浓度在0、0.390、1.560、12.500以及25.000 μM时，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 毛兰素对葡萄膜黑色素瘤细胞核形态的影响

根据DAPI染色结果发现，未加毛兰素处理的对照组细胞核较完整，未见明显凋亡形态。毛兰素处理后细胞数量明显减少，且细胞数量随浓度增加而逐渐减少，同时高倍镜下可见部分细胞呈典型凋亡形态，提示毛兰素中存在可诱导细胞凋亡的组分，且随着浓度的增加，凋亡的细胞增多。见封三图1。

2.3 毛兰素对葡萄膜黑色素瘤细胞周期的影响

MUM-2B和C918细胞周期的结果显示，在毛兰素作用下，两株细胞G2/M期细胞比例均有明显增加，且随着毛兰素作用浓度的增加，G2/M期的细胞比例逐渐增加，同时S期和G0/G1期的细胞比例降低，呈现一定的剂量依赖性，表明毛兰素可能通过将细胞阻滞在G2/M期，从而诱导细胞凋亡（封三图2A）。当毛兰素作用浓度达到20 μmol/L时，MUM-2B细胞G2/M期比例由对照组时的19.03%增加至25.46%，C918细胞G2/M期比例由22.51%增加至29.83%（封三图2B）。

2.4 毛兰素对葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡的影响

毛兰素处理24 h后，MUM-2B和C918细胞进行Annexin V/PI双染色，结果显示早期凋亡和晚期凋亡细胞比例均随毛兰素作用的浓度增加而逐渐增加，体现为R3和R5区域细胞比例的逐渐增加（封三图3）。毛兰素作用浓度达到20 μmol/L，MUM-2B早期凋亡和晚期凋亡细胞比例均达到最大，分别为（37.01±3.52）%和（18.53±2.01）%，C918早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞比例分别为（32.91±3.12）%和（19.04±2.31）%。说明毛兰素能够诱导葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡，与上述实验得出的推论一致。见表2。

2.5 毛兰素对增殖和凋亡相关蛋白的影响

MUM-2B和C918细胞经毛兰素处理24 h后，提取总蛋白，进行免疫印迹分析，结果表明随着毛兰素作用浓度的增加，PARP总蛋白水平有显著下调，p38 MAPK总蛋白有一定程度的下调，而p21、PARP活化形式（cl-PARP）和Caspase-3的活化形式（cl-Caspase3）显著上调。见图1。

3 讨论

葡萄膜黑色素瘤为成人眼内常见恶性肿瘤，5年生存率在17%～50%，主要死因为肝转移，目前尚无有效治疗手段[9]。开发抗葡萄膜黑色素瘤的药物为目前的当务之急。中药是我国最宝贵的传统文化之一，从中药入手分离出具有生物活性的中药单体对于抗癌药物开发具有重要意义，天然单体中有很多难以合成的结构，不少具有广泛的生物学活性。毛兰素作为石斛中分离出单体中的一种，已被证实具有较显著的抗肿瘤药理活性[10]，但是毛兰素对葡萄膜黑色素细胞的作用未被报道过。

本研究显示，毛兰素可显著抑制2株葡萄膜黑色素瘤细胞株的增殖，且有浓度依赖性，既往研究显示，毛兰素对多种肿瘤均有显著的抑制效果，如膀胱癌[11]、肝癌[12]、肠癌[13]、乳腺癌[14]、胃癌[15，16]等，作用浓度在纳摩尔和微摩尔之间，提示不同的癌细胞类型对毛兰素的敏感性不同。为进一步探讨毛兰素抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的机制，本文检测了毛兰素作用后细胞周期的变化，MUM-2B和C918細胞在毛兰素作用后均存在较为显著的G2/M期阻滞，表现为随毛兰素浓度增加，G2/M期比例逐渐增加，这一结果也与其他研究报道相符[7，17]。对细胞增殖相关蛋白表达量进行检测。MAPK信号通路是维持细胞存活的重要通路[18]，被活化后可磷酸化核转录因子和蛋白激酶等多种底物，调节相关基因转录，促进细胞增殖，也被认为是细胞非控制性分裂的主要信号通路，在黑色素瘤细胞增殖过程中通过传递胞外信号发挥重要作用。研究显示，UM中存在MAPK通路的异常活化[19]，并与皮肤中的黑色素瘤活化情况有所不同，对UM的侵袭和转移均有影响。p38 MAPK是MAPK通路的其中一个亚型，其功能与细胞增殖、分化、存活、迁移密切相关，因而被用于研究癌细胞成因，且已被证明其在癌细胞中调节失控。本研究发现，毛兰素作用MUM-2B和C918细胞后，p38 MAPK表达量均显著下调，提示毛兰素能抑制MAPK信号通路活化。

随后通过Annexin V/PI染色进一步证实，毛兰素可诱导细胞凋亡，体现为晚期和早期凋亡水平随毛兰素浓度增加而比例增加，对凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的活化形式检测，表现为随毛兰素浓度增加而上调，进一步证实毛兰素可诱导凋亡发生，与之前在膀胱癌中的研究相符[11]，但也有研究报道毛兰素作用后未见有Caspase-3的活化[20]。Caspase-3 为细胞实现凋亡通路的主要功能蛋白，不论是外源性或者内源性通路最终汇总信号，通过活化Caspase-3启动凋亡。由此可以推断，毛兰素可能还存在其他诱导细胞死亡的通路。

综上所述，毛兰素能够有效抑制葡萄膜黑色素瘤细胞C918、MUM-2B增殖，阻滞细胞周期，促进葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡，且其作用效果呈现出一定范围内的剂量依赖性。其作用机制为毛兰素能抑制p38 MAPK表达，阻断MAPK信号通路，活化细胞凋亡途径关键蛋白Caspase-3和PARP。后期我们将考虑进一步的体内研究，以明确其对葡萄膜黑色素瘤的抑制效果。

[参考文献]

[1] 向中正，刘磊. 葡萄膜黑色素瘤诊疗进展[J]. 华西医学，2018，33（11）：1433-1440.

[2] 张雪琴，赵庭梅，刘静，等. 石斛化学成分及药理作用研究进展[J]. 中草药，2018，49（13）：3174-3182.

[3] 庄梦婕，成景瑞，明海霞. 肿瘤失巢凋亡机制及其中医药对肺癌的治疗研究进展[J]. 解放军药学学报，2016， 32（6）：551-554.

[4] Hsu JL，Lee YJ，Leu WJ，et al. Moniliformediquinone induces in vitro and in vivo antitumor activity through glutathione involved DNA damage response and mitochondrial stress in human hormone refractory prostate cancer[J].J Urol，2014，191（5）：1429-1438.

[5] Li YM， Wang HY， Liu GQ. Erianin induces apoptosis in human leukemia HL-60 cells[J]. Acta Pharmacol Sin，2001，22（11）：1018-1022.

[6] Sun J，Fu X，Wang Y，et al. Erianin inhibits the proliferation of T47D cells by inhibiting cell cycles，inducing apoptosis and suppressing migration[J]. Am J Transl Res， 2016，8（7）：3077-3086.

[7] Wang H，Zhang T，Sun W，et al. Erianin induces G2/M-phase arrest，apoptosis，and autophagy via the ROS/JNK signaling pathway in human osteosarcoma cells in vitro and in vivo[J]. Cell Death Dis，2016，7（6）：e2247.

[8] Yu Z，Zhang T，Gong C，et al. Erianin inhibits high glucose-induced retinal angiogenesis via blocking ERK1/2-regulated HIF-1α-VEGF/VEGFR2 signaling pathway[J]. Sci Rep，2016，6：34306.

[9] 裴超，刘静霞. 脉络膜黑色素瘤的研究进展[J]. 国际眼科杂志，2017，17（12）：2256-2259.

[10] 张小莉，安云鹤，程小艳，等. 毛兰素抗肿瘤活性研究进展[J]. 分析仪器，2018，（1）：212-216.

[11] 朱启彧. 毛兰素诱导膀胱癌细胞凋亡及其分子机制[D]：西南交通大学，2013.

[12] 苏鹏，王晶，安君霞，等. 毛兰素对人肝癌Huh7细胞的抑制作用[J]. 应用与环境生物学报，2011，17（5）：662-665.

[13] 王亚芸. 石斛生物碱提取及其抑制Caco-2活性的研究[D] ：北京林业大学，2015.

[14] 孙婧. 铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素对人乳腺癌细胞抑制作用的研究[D]. 吉林大学，2016.

[15] 刘名昆. 毛兰素联合5-Fu对人胃癌细胞株MGC-803增殖凋亡的影响[D] ：南华大学，2016.

[16] 洪卫，郭勇，马胜林，等. 毛兰素对胃癌细胞SGC-7901端粒酶活性的影响[J]. 浙江实用医学，2009，14（3）：181-182.

[17] Zhu Q，Sheng Y，Li W，et al. Erianin，a novel dibenzyl compound in Dendrobium extract，inhibits bladder cancer cell growth via the mitochondrial apoptosis and JNK pathways[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2019，371：41-54.

[18] 尹起亮，于莹莹，吴荻. 靶向MAPK信号通路的晚期黑素瘤治疗现状及展望[J]. 肿瘤，2018，38（8）：811-818.

[19] Zuidervaart W，van Nieuwpoort F，Stark M，et al. Activation of the MAPK pathway is a common event in uveal melanomas although it rarely occurs through mutation of BRAF or RAS[J]. Br J Cancer，2005，92（11）：2032-2038.

[20] 洪衛，马胜林，杜灵彬，等. 毛兰素诱导胃癌细胞SGC-7901凋亡的实验研究[J]. 中国肿瘤，2008，（6）：499-501.

（收稿日期：2019-04-11）