淫羊藿苷对兔股骨MEG3、H19和DANCR表达的影响

张传志 周庾 胡晓波 刘莉

重庆市中医院(重庆市第一人民医院)骨二科,重庆 400100

绝经后骨质疏松症是由雌激素水平下降引起的一种全身性骨代谢疾病，其发病率在老年妇女中高达52%[1]。 既往研究[2]表明，mRNA在细胞增殖、分化、分裂、凋亡和信号转导过程中起着重要作用，并参与了多种疾病的发生和发展。而最近的研究[3-4]证实，各种长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)如母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)，可通过调控转录、转录后以及表观遗传学水平来参与疾病的发生，是一种重要的调节因子。越来越多的证据[4-5]表明MEG3在调控骨髓间充质干细胞的分化过程中起着重要作用。MEG3与BMSC的异常分化诱导密切相关，但是MEG3与绝经后骨质疏松症的关系尚未见报道。研究发现[6-7]长链非编码RNA H19、DANCR可调节成骨细胞的增殖和分化。三种长链非编码RNA已在体外实验中被证明了其对成骨细胞的调节作用，但在体内的影响还未开展相关研究。淫羊藿苷是从天然植物中提取的黄酮类药物，已被证明有促进成骨与抑制破骨的双重作用。本研究旨在通过淫羊藿苷干预骨质疏松新西兰白兔，检测其不同部位骨的长链非编码RNA MEG3/H19/DANCR的表达情况，同时研究其对股骨显微结构变化的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1建立OVX模型：选取未生育的7月龄健康成年新西兰白兔48只，体重(1.6±0.29)kg。在10天的适应期后，根据体重随机分为假手术组、去卵巢模型组(OVX)和淫羊藿苷治疗组(OVX加治疗)。 假手术组实施手术切除双侧卵巢周围脂肪一块；去卵巢模型组与淫羊藿苷治疗组在使用戊巴比妥钠(30 mg/kg)对腹腔进行注射全麻后，行双侧卵巢切除术，双侧切口长约3～4 cm。术后每天观察动物的切口直至愈合。

1.1.2淫羊藿苷给药：行双侧卵巢切除术后4周，淫羊藿苷治疗组给予淫羊藿苷[20 mg/(kg·d)]灌胃[8]，去卵巢模型组与假手术组每天给予等量的生理盐水灌胃，持续8周。术后12周，对实验动物实施安乐死后取其双侧的股骨与腰椎(L5)备用。

1.2 方法

1.2.1Micro-CT分析骨质疏松模型的建立：用70%的乙醇对取得的新西兰白兔股骨进行固定。24 h后对股骨头进行micro-CT(SkyScan 1072)扫描，使用相关分析软件(SkyScan，Belgium)进行分析，图像采集时所选择的电压和电流为100 kV、98 mA，将样本密封在紧密的塑料包里以避免在扫描过程中出现移动或样品出现脱水。对图像进行阈值分割以从背景图像中分割出骨的图像。通过配套的3D软件将2D图像通过3D渲染获得3D模型。微CT图像分辨率为18.2 μm。再根据三维图像对标本的骨参数进行分析，具体包括：骨体积/总体积(BV/TV)，骨表面积/骨体积(BS/BV)，骨小梁的分离度Tb·Sp，骨小梁的厚度Tb·Th，骨小梁的数量(Tb·N)。

1.2.2qRT-PCR检测：在骨质疏松模型建立的第12周时通过qRT-PCR检测两组股骨、椎骨组织中长链非编码RNA MEG3、H19、DANCR的表达水平以及Runx2的mRNA表达水平。根据试剂盒说明书用Trizol提取细胞的总RNA(Invitrogen)。实验设6个复孔，通过紫外分光光度计测定总RNA浓度。总RNA的反转录遵循反转录试剂盒(Thermo)操作说明，PCR的扩增使用实时定量PCR的预混合溶液SYBR Green qPCR Master Mix(Thermo)，扩增之后的MEG和Runx2的相对表达分析以GAPDH 作为内源参照基因，引物由上海生工合成，具体见表1。独立的实验重复3次以减少误差，结果的计算采用2-ΔΔCt法。

表1 qRT-PCR中应用的引物序列Table 1 The primer sequences for qRT-PCR

1.2.3免疫组化检测BMP2：采用S-P法，假手术组和去卵巢模型组一抗用磷酸盐缓冲液(PBS)代替,其余各步均同淫羊藿苷治疗组，步骤如下：①切片脱蜡入水：将切片分别浸泡于二甲苯液中30 min、无水酒精中5 min、95 %酒精中5 min、75 %酒精中5 min，用蒸馏水清洗2次，在PBS(pH=7.4)中浸泡5 min；②内源性过氧化物酶阻断：滴加A液50 μL于切片上，室温孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；③抗原修复：切片浸泡于0.1 mol/L EDTA修复液中,加温至99 ℃并保持10 min，任其自然冷却至室温，在PBS中浸泡5 min(3次)；④非免疫血清封闭：滴加B液50 μL于切片上，室温孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑤滴加一抗：淫羊藿苷治疗组滴加鼠抗兔抗体，假手术组和去卵巢模型组使用PBS代替，室温下孵育60 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑥滴加二抗：滴加羊抗鼠抗体液于切片上，室温孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑦滴加抗生物-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑧滴加过氧化物酶底物，显微镜下观察6 min，当部分切片出现较强的棕黄色产物时，用PBS终止显色反应，在PBS中浸泡5 min(3次)；⑨用蒸馏水冲洗，在盐酸中浸泡2 s后再用蒸馏水冲洗；⑩脱水、封片：在95 %酒精中浸泡5 min，在无水酒精中浸泡10 min，烘干，镜下观察，显微摄影。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 显微CT分析骨质疏松模型的建立

由表2、图1可见，骨质疏松模型建立成功。与去卵巢模型组相比，经淫羊藿苷干预后，骨质疏松兔股骨头的BV/TV升高了41.86 %(P<0.01)、Tb·Th升高34.78 %(P<0.05)、Tb·N升高41.05 %(P<0.01)，BS/BV降低30.76 %(P<0.05)，Tb·Sp降低36.58 %(P<0.05)。

表2 显微CT对股骨头的显微结构分析结果Table 2 Results of microct analysis of

注：与去卵巢模型组比较，**P<0.01；与去卵巢模型组比较，*P<0.05。

图1 股骨3D图像Fig.1 3D image of femur

2.2 不同部位骨的长链非编码RNA MEG3/H19/DANCR的表达情况

表3所示，淫羊藿苷治疗组股骨中MEG3、H19、DANCR的表达与去卵巢模型组相比明显升高，分别升高38.1 %(P<0.01)、44.9 %(P<0.01)、49.15 %(P<0.01)，椎骨中H19、DANCR的表达与去卵巢模型组相比无明显变化(P>0.05)，MEG3的表达与去卵巢模型组相比升高64 %(P<0.01)。颅骨中MEG3、H19的表达与去卵巢模型组相比无明显变化(P>0.05)，然而DANCR的表达与去卵巢模型组相比升高了31.25 %(P<0.05)。股骨、椎骨(L5)、颅骨中Runx2与去卵巢模型组相比分别升高32.97 %(P<0.05)、29.79 %(P<0.05)、29.41 %(P<0.05)。

表3不同部位骨中lncRNA MEG3/H19/DANCR的表达

Table3Expression of lncRNA MEG3/H19/DANCR in different bones

基因 假手术组去卵巢模型组淫羊藿苷治疗组股骨MEG31.05±0.090.63±0.08∗∗0.87±0.11∗∗lnc-H191.31±0.070.49±0.040.71±0.06∗∗DANCR1.14±0.080.59±0.05∗∗0.88±0.09∗∗Runx21.58±0.080.91±0.16∗1.21±0.14∗椎骨MEG30.49±0.050.25±0.07∗∗0.41±0.4∗∗lnc-H190.99±0.110.87±0.090.93±0.12DANCR0.84±0.050.83±0.120.97±0.1Runx20.86±0.140.47±0.13∗0.61±0.12∗颅骨MEG30.29±0.090.31±0.080.27±0.11lnc-H190.58±0.080.51±0.070.46±0.06DANCR0.35±0.050.16±0.02∗0.21±0.03∗Runx20.63±0.090.34±0.04∗∗0.44±0.09∗

注：与去卵巢模型组比较，**P<0.01；与去卵巢模型组比较，*P<0.05。

2.3 免疫组化检测股骨颈中BMP2的表达

由图2可知，三组免疫组化结果中，淫羊藿苷治疗组胞浆、核周或细胞外基质的棕黄色颗粒状染色最多，说明淫羊藿苷治疗组股骨颈中的BMP2表达最高，其次为假手术组，去卵巢模型组股骨颈中的BMP2表达最低。

图2 免疫组化检测股骨颈中BMP2的表达Fig.2 Immunohistochemical detection of BMP2 expression in the neck of femur

3 讨论

淫羊藿苷是淫羊藿中含量最丰富的一种黄酮类成分，具有良好的骨再生和修复作用[9]。越来越多的证据[10]表明淫羊藿苷可通过刺激骨形成同时抑制骨吸收而在骨转化的平衡中发挥双重作用，因此天然植物中提取的淫羊藿苷成为了防治骨质疏松症的一种具有潜力的替代品。重要的是，作为一种结构稳定的药物，它可以加载在生物材料上进成局部的释放，形成局部的骨诱导[11-12]。最新的证据[13]表明，lncRNA是一种长度≥200个核糖核酸的非编码RNA，它在多种生物学过程(如转录调控、细胞生长和肿瘤发生)中起着重要作用。既往研究关注于骨质疏松治疗药物对mRNA的影响，然而越来越多的证据[14-15]表明MEG 3对骨髓间充质干细胞的分化具有调控作用。研究发现[16]，绝经期后MEG 3和miR-133a-3p的表达在骨髓间充质干细胞中的表达呈正相关，长链非编码MEG3通过靶向调控miR-133a-3p的表达从而抑制绝经后骨质疏松症骨髓间充质干细胞的成骨分化。长链非编码RNA H19仅从母系遗传等位基因转录，不编码蛋白质，H19在进化过程中高度保守以及外显子的突变率很低的特点使其具有重要的生物学功能，同时，H19已被证明是成骨细胞增殖和分化的关键调节因子之一[6,17]，因此笔者推测H19可能与骨相关疾病有关。研究还发现DANCR可通过诱导的IL-6和TNF-α促进骨的吸收，可以作为绝经后骨质疏松症的生物标志物[7]。此外，DANCR还可调节成骨细胞的分化，是成骨细胞分化的重要介质[18]。因此本次研究把焦点放在这3个长链非编码RNA上，探讨了淫羊藿苷对这3种非编码RNA在骨质疏松兔股骨、腰椎(L5)、颅骨上表达的影响。笔者在淫羊藿苷干预骨质疏松模型中发现淫羊藿苷干预后股骨中H19的RNA表达上调，与之前的研究一致[19]。

研究表明，RUNX 2是成骨细胞生长的关键性因子，在对821名西班牙绝经期妇女的研究中[20]发现，RUNX2与腰椎和股骨颈的骨密度有关。此次研究通过PCR检测发现淫羊藿苷干预骨质疏松兔模型的RUNX2。BMP 2(骨形态发生蛋白-2)通过促进间充质细胞分化为成骨细胞，从而促进骨形成与修复；此次研究的免疫组化结果显示，经淫羊藿苷治疗后的BMP2在股骨颈中表达最高。本次研究中证明淫羊藿苷对骨质疏松兔的模型有明显效果，与之前的研究[9]一致，外源性的淫羊藿苷对骨质疏松的作用表现在使胫骨的骨小梁增加。有意思的是，淫羊藿苷对长链非编码RNA(MEG3、H19、DANCR)的影响主要表现在股骨，对椎骨、颅骨的影响分别表现在MEG3和DANCR的影响，淫羊藿苷可通过促进股骨的MEG3、H19、DANCR的表达来促进骨质疏松的治疗。

综上，股骨中3个lncRNA(MEG3、H19、DANCR)的表达与成骨基因RUNX2和BMP2表达上调有关。由于本次研究具有局限性，未来的研究可以进一步验证不同骨中lncRNA(MEG3、H19、DANCR等)的表达与成骨基因RUNX2和BMP2的关系，以及淫羊藿苷影响骨质疏松具体的信号转导机制。