免疫检查点抑制剂在胰腺癌联合治疗中的最新进展

赵锦涵， 常 江， 钏莉雪， 杨晓玲， 庄 琳

昆明医科大学第二附属医院消化内科，云南 昆明 650101

预计到2030年胰腺癌将超过乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌，成为美国和欧洲第二大癌症相关死亡原因[1]。胰腺癌5年生存率不超过7%[2]。统计显示，2017年美国胰腺癌新发病例为53 670例，约43 090例死于胰腺癌[3]。胰腺癌发现迟、转移早、进展快、预后差，目前根治性手术切除是唯一可能治愈的方法，但手术切除率不足20%，中位生存期仅为6个月[4]。免疫疗法为癌症的治疗铺开了一条新道路，但免疫检查点抑制剂(checkpoint inhibitors，CPI)单药治疗并未对胰腺癌产生显著影响，肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)被认为是使胰腺癌对免疫疗法耐受的主要原因[5]。本文将从这些免疫疗法失败的基础生物学机制入手，为CPI创新性联合治疗方法提供理论基础，概述目前正在研究的胰腺癌中CPI联合疗法最新进展。

1 CPI

T细胞为抗肿瘤免疫的核心执行者，其表面不仅可表达共刺激的信号分子对T细胞进行活化，而且还通过表达共抑制信号分子对主要组织相容性复合体-T细胞受体(MHC-TCR)信号通路进行负调控，从而达到调控T细胞寿命、增殖、分化等作用，而这些免疫抑制信号即为免疫检查点。在肿瘤的发生、发展中，占优势的免疫检查点成为免疫耐受的主要原因，肿瘤抗原通过表达抑制性的配体和受体，抑制T细胞活性，从而逃避免疫监视，因此，阻断免疫检查点可以加强抗肿瘤免疫反应[6]。程序性细胞死亡蛋白-1(programmed death protein-1，PD-1)及配体-1/2(programmed death-ligand1/2，PD-L1/2)，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T-lymphocyt-associated antigen 4，CTLA-4)是目前研究比较透彻的免疫检查点。

近年来，由于CPI在实体瘤治疗中显现出令人鼓舞的结果，临床相继批准将其用于多种恶性肿瘤中，抗PD-1药物Pembrolizumab和Nivolumab及CTLA-4抗体Ipilimumab和Tremelimumab已获得FDA批准用于黑色素瘤等实体瘤的治疗。研究[7-9]表明，非小细胞肺癌、肾癌、黑色素瘤患者在Nivolumab单药治疗后，获得了更长的生存期(生存期分别达到9.9个月、22.4个月及16.8个月)，在另一个单独使用Pembrolizumab对411例黑色素瘤患者进行治疗的Ⅱ期临床研究中，72%患者肿瘤缩小，缓解率达34%[10]。然而，CPI单药治疗并未改善胰腺癌患者的预后。一项Ⅱ期试验中[11]，27例局部进展或转移的胰腺癌患者接受Ipilimumab治疗2周期后复查，无患者出现病情缓解，仅有1例患者在继续用原方案治疗1周期后疾病出现延迟性的部分缓解。另一项关于抗PD-L1单抗的Ⅰ期试验在包括14例胰腺癌在内及其他恶性肿瘤共207例患者的试验中，未观察到胰腺癌客观缓解的患者[12]，以上研究均提示,胰腺癌单用CPI疗效不佳，最新的研究正在试图通过CPI联合疗法提高抗瘤疗效。

2 CPI单独治疗胰腺癌效果不佳的可能原因

2.1 TMETME在胰腺癌中的特点是引起强烈的促结缔组织增生反应，从而导致胰腺癌细胞周围产生致密的纤维化基质，这层基质由肌成纤维细胞、胰腺星状细胞、成纤维细胞、血管、细胞外基质、免疫细胞、细胞因子和生长因子等细胞和非细胞成分组成[13]，其作为肿瘤周围的机械和功能屏障，会引起瘤内高压力和微血管低密度，从而导致灌注受损和药物传输受限。此外TME中效应性T细胞、Th1型、NK细胞、DC细胞及TAMs(M1)数量减少，活性下降，而调节性T细胞(Tregs)、Th2型、MDSCs及TAMs(M2)等抑制性免疫细胞聚集[14]，TGF-β1、IL-10、IL-35、CCL5、CXCL12等众多免疫调节因子也参与形成胰腺癌免疫抑制的微环境，可见TME中存在多种单用CPI治疗效果不佳的免疫抑制机制。

2.1.1 胰腺癌对CPI单独治疗原发性耐药的机制：诸多证据表明[15]，肿瘤细胞内因素和肿瘤细胞外因子都参与了胰腺癌对CPI的原发性耐药。黑色素瘤、肺鳞状细胞癌或肺腺癌等免疫活性肿瘤对CPI敏感是由于存在大量CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，而胰腺癌(不包括错配修复缺陷)是一种免疫静止性肿瘤，其特征是缺乏效应T细胞的浸润，而这突出特性归因于TME，TME中的纤维化基质可能阻碍TILs进入肿瘤[16]，TME中抑制性受体或配体分子高表达，引起T细胞处于耗竭状态，TME中浸润的免疫抑制性细胞可通过接触依赖或旁分泌的方式，直接或间接地影响CD8+T细胞活性，最终导致对CPI的原发性耐药。

研究[17]发现，只有肿瘤内新抗原异质性较低，同时具有较多数量的克隆源性新抗原患者对CPI治疗才更为敏感，而胰腺癌在本质上是一个低突变负担或低表达新抗原的肿瘤。故而对CPI的抗肿瘤反应不佳。

胰腺癌TME中Treg 细胞浸润增多不仅可以抑制抗肿瘤免疫的活性，还可通过抑制CD4+/CD8+T淋巴细胞、NK细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等多种途径协助TME重塑，介导肿瘤细胞免疫逃避、促进肿瘤侵袭转移，从而使CPI收效甚微，提高效应T细胞/Tregs比值，则不易产生耐药性[18]。

此外，胰腺癌细胞通过表达PD-L1和吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)等逃避宿主抗肿瘤免疫应答的能力，IDO过度活化还可导致色氨酸缺乏、促炎因子前列腺素E2及腺苷酸等免疫抑制类代谢产物聚集，抑制T细胞活化，导致T细胞耗竭，从而影响CPI单药治疗的疗效[19]。

2.1.2 胰腺癌对CPI单独治疗获得性耐药的机制：多种抑制性免疫检查点分子如 PD-L1、Tim3、CTLA-4等，共同促进肿瘤的免疫逃逸。抗PD-1免疫治疗发生耐药的主要机制是选择性激活新的免疫检查点T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM3)，从而导致免疫逃逸，该分子以类似PD-1/PD-L1抑制T细胞功能及促进T细胞衰竭的方式促使免疫逃逸[20]。SAKKUISHI等[21]在诱导抗PD1耐药的小鼠模型中发现，TIM3表达上调可能与PD1治疗抗性增加有关，且这一结果在2例抗PD1治疗失败的肺腺癌患者中得到了验证。

上述胰腺癌对CPI治疗耐药的机制与TME密切相关，也为我们针对这些局限性采取CPI联合治疗提供了思路和理论基础，联合免疫治疗可以通过改善诸多耐药机制弥补单一疗法的不足，发挥协同抗肿瘤作用。

3 CPI在胰腺癌中的联合免疫治疗策略及依据

3.1 CPI与细胞因子抑制剂联合治疗细胞因子抑制剂靶向治疗除直接杀死肿瘤细胞外，还可通过释放促炎因子、增加肿瘤抗原呈递及识别、促进免疫细胞浸润等，调变TME，因而可能成为联合CPI治疗胰腺癌的重要策略。

3.1.1 CPI与IL-6抑制剂联合治疗：CPI和IL-6抑制剂联用可使肿瘤内效应T细胞增多和T细胞Th1表型增加。MACE等[22]在临床前研究表明，IL-6抑制剂和PD-L1抗体阻断剂联合治疗后肿瘤内CD8+T细胞数量比CPI单独拮抗高，抗肿瘤活性增强，且PC小鼠模型的总生存率比CPI单药治疗提高了35%。选用IL-6抑制剂用于联合治疗的原因如下：首先，IL-6靶向抗体是FDA批准的可用于其他适应证的药物，故易于将其用于肿瘤治疗；其次，IL-6可能来源于TME中胰腺基质的胰腺星状细胞和肿瘤相关的髓样细胞，而IL-6可以促进免疫抑制和PC进展，IL-6/STAT3轴可以同时促进免疫抑制细胞的扩增或改变T细胞亚群的平衡[22]；最后，IL-6抑制剂可以调节胰腺癌患者的髓系和T细胞的表型特征，使其对免疫治疗更有效。

3.1.2 CPI与BAG3抗体联合治疗：BAG3是热休克蛋白70的共同伴侣，其在应激反应中诱导后表达。BAG3与CPI联用可减少TME中TAMs(M2)的数量。IORIO等[23]最近发现,BAG3由胰腺癌细胞分泌并结合到肿瘤相关巨噬细胞，从而诱导其活化，并促进肿瘤生长和转移的相关因子的释放。IORIO等[23]用抗BAG3单克隆抗体、抗PD-1抗体及两者联合治疗对同种异体移植的胰腺癌小鼠治疗19 d后，发现在两种抗体联合治疗的小组，肿瘤生长显著减少，巨噬细胞浸润也减少了。肿瘤切片分析显示，CD8+T细胞在对照肿瘤组中几乎不可检测，而在抗BAG3或抗PD-1抗体后其数量增加，两者联合治疗后其CD8+T细胞数量显著增加。

3.1.3 CPI与巨噬细胞来源的颗粒蛋白靶向剂联合治疗：TME可以抑制和排除细胞毒性CD8+T细胞从而使癌细胞躲避免疫攻击，然而，检测点阻断剂发挥作用的重要前提是肿瘤浸润CD8+T细胞。QUARANTA等[24]在研究中观察到CD8+T细胞的浸润及其功能在转移进展期间消失。巨噬细胞来源的颗粒蛋白(用集落刺激因子-1可诱导巨噬细胞表达颗粒蛋白)是转移性胰腺癌中对T细胞产生排斥的关键诱导物，颗粒蛋白的耗竭可减少纤维化基质的形成，从而恢复转移部位T细胞的浸润，使胰腺癌对检查点抑制剂(如PD-1)疗法敏感，QUARANTA等[24]研究显示,该颗粒蛋白缺陷并伴随着M1样巨噬细胞数量增加的小鼠对PD-1阻断剂治疗产生了显著反应，并提供了支持将颗粒蛋白靶向剂与免疫检查点阻断剂联合用于转移性胰腺癌治疗的临床前数据。

3.1.4 CPI与CCKR拮抗剂联合治疗：胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)已被证明可刺激胰腺癌的生长，CCK受体(cholecystokinin receptor，CCKRs)存在于胰腺癌细胞成纤维细胞和淋巴细胞上，SMITH等[25]在胰腺癌的小鼠模型中测试了单用CCKR拮抗剂、单用CPI及两者联用的治疗效果，发现联合治疗的方法使携带同基因胰腺癌的具有免疫活性的小鼠存活时间更长，肿瘤免疫组织化学染色和流式细胞术显示组合方案治疗的小鼠肿瘤FOXP3+T调节细胞显著减少，CD4+和CD8+淋巴细胞有所增加，且CCKR拮抗剂治疗诱导了肿瘤浸润淋巴细胞的流入并减少了纤维化。丙谷胺是一种可优先选择的拮抗剂，可同时阻断CCK-A和CCK-B受体。丙谷胺最初为治疗消化性溃疡的老药，已批准其最高剂量可达1 200 mg，在胰腺癌患者中使用CCKR拮抗剂的另一潜在优势是可改善癌痛[26]，因此，将CCKR拮抗剂与CPI联合用于临床实践是极有可能实现的新方案。

其他目前正在临床试验中与CPI联合应用的小分子或单克隆抗体靶向剂还有细胞集落刺激因子1受体(CSF1R)、TGFβ、CCR4、CXCR2和CXCR4/CXCL12等[27]。

3.2 CPI与疫苗联合使用单用肿瘤疫苗存在MHC限制性、有效率低、免疫耐受等问题，而TME中效应T细胞的功能状态与疫苗治疗效果密切相关，且TME中Treg细胞高表达与免疫耐受相关，CPI可以抑制TME中的Treg细胞比例，提高肿瘤内效应T细胞数量，增强疫苗的抗肿瘤作用，此为CPI与疫苗联合使用的理论依据[10]。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子疫苗(GVAX)注射入机体后可动员肿瘤部位的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞等产生抗肿瘤免疫反应。胰腺导管腺癌模型鼠采用GVAX联合抗PD-1治疗显著改善了小鼠的存活率[28]。2012年美国临床肿瘤学会胃肠道癌症研讨会发布的Ⅰb期研究结果显示[29]，GVAX联合Ipilimumab治疗PC与单独使用Ipilimumab相比，可使胰腺癌患者生存率提高60%，既往接受过治疗、晚期或肿瘤转移患者的中位生存期从3.3个月提高到5.5个月，而且1年后存活患者的数量几乎翻了两番。另一个Ipilimumab联合GVAX疫苗治疗胰腺癌的临床试验中[30]，30例胰腺癌患者被随机分为两组，Ⅰ组给予Ipilimumab治疗，Ⅱ组给予Ipilimumab+GVAX疫苗治疗，结果显示,Ⅰ组仅有2例患者处于疾病稳定状态，但无肿瘤标志物CA199的下降，而Ⅱ组有3例表现病情稳定状态，7例患者肿瘤标志物CA199下降。Ⅰ、Ⅱ组的中位生存期分别为3.6个月和5.7个月，并且在生存期>4.3个月的患者中观察到间皮素特异性T淋巴细胞数量及T细胞库的上升，表明Ipilimumab和GVAX疫苗联合治疗对胰腺癌患者有潜在的临床效益。另CURRAN等[31]和DURAISWAMY等[32]表明，PD-1和CTLA-4双重阻断剂与疫苗联合使用在多个临床前模型中可更有效地根除肿瘤。

3.3 CPI与溶瘤病毒治疗联合使用溶瘤病毒治疗是通过对肿瘤细胞进行直接感染、复制从而诱导肿瘤反应，并最终使癌细胞裂解的一种策略。细胞裂解同时释放损伤相关的分子模式分子，其可以触发先天和适应性免疫应答[33]。其中，基于腺病毒的溶瘤病毒疗法现已被大量评估。ONYX-015是E1B-55 kD区域缺失的腺病毒，其选择性地复制并裂解p53异常的肿瘤细胞。在1项Ⅰ/Ⅱ期(NCTO1479465)ONYX-015和吉西他滨联合治疗进展期胰腺癌的研究中，11例患者中4例出现了部分缓解。另一种溶瘤病毒治疗利用呼肠孤病毒，其在具有活化RAS途径及溶血素的细胞中优先复制。在Ⅱ期研究(NCT01044069)中，29例转移性PAC患者中1例出现缓解。在溶血素治疗的患者中PD-L1上调，这再次提示溶瘤性病毒治疗在PC中潜在的免疫调节作用。另一项Ⅱ期研究[34]显示,使用溶血素、Pembrolizumab和化疗联合治疗的11例胰腺癌患者显示出具有可控安全性的抗肿瘤活性。其中的5例可评估患者中，2例病情稳定(126 d和221 d)，1例部分缓解持续时间>6个月。使用溶血素联合CPI的后续临床研究正在进行中。

3.4 CPI与MEK抑制剂联合使用胰腺癌的特征是在>90%的病例中存在KRAS突变，这引起我们对胰腺癌中下游通路如MEK(MAP-ERK kinase)的很大兴趣。MEK抑制剂(MEK-I)通过增加MEK-I表达和增加TIL的活性和存活率，同时减少巨噬细胞和骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)浸润和肿瘤细胞PD-L1表达来增强PD-L1阻断剂单药治疗效果[35]。MEK-I单独使用并未提高胰腺癌患者的存活率，然而，MEK-I与免疫疗法的组合则可发挥协调作用。在一组包含65 671例衍生肿瘤的队列研究中MEK-I和抗PD-1联合治疗比起抗PD-1单独治疗，显示出对肿瘤生长和肿瘤消退的更大抑制作用[36]，Ⅰb期研究表明，在微卫星稳定的结直肠癌肿瘤患者(主要是KRAS突变)中使用Cobimetinib(MEK-I)和Atezolizumab(抗PD-L1)组合疗法后可观察到持久的客观反应，但CPI与MEK-I联合治疗胰腺癌尚未进入临床试验阶段，目前鲜有报道。

3.5 CPI与肿瘤缺氧微环境靶向剂联合治疗Evofosfamide(TH-302)是一种细胞毒性前体药物，在缺氧条件下被激活从而靶向低氧肿瘤区域。目前正在探索将其作为免疫治疗的组合伙伴，因为它可以改善肿瘤组织供氧并减少MDSC的募集，增加效应T细胞活性[37]。TH-302与CPI联合使用极可能恢复有利的免疫环境。TH-302与Ipilimumab联合治疗胰腺癌的Ⅰ期临床试验正在进行中。

3.6 CPI与化疗联合使用CPI与化疗联用能够有效激活大量的细胞毒性T细胞，同时抑制TME中的免疫抑制细胞，促进CPI与T细胞活性功能相结合，改善CPI的耐药问题。已有早期临床试验将吉西他滨与CTLA4抗体阻断剂结合进行治疗。在吉西他滨与Tremelimumab联合治疗28例胰腺癌患者的Ⅰ期试验(NCT00556023)中，2例患者获得部分缓解(PR)，7例患者疾病稳定(SD)>10周[38]。在另一项吉西他滨和Ipilimumab联合治疗16例患者的Ⅰb期临床试验中，2例患者获得PR，5例患者出现SD。最近，一项白蛋白结合型紫杉醇联合或不联合吉西他滨与Nivolumab的Ⅰ期试验(NCT00844649)显示17例转移性胰腺癌患者中12例总体耐受性良好且疾病控制(SD或PR)[39]。这至少为我们提供了将免疫检查点抑制剂与化疗相结合可能获得临床效益的信号。

4 结语和展望

TME导致胰腺癌对CPI单一疗法具有抗性和耐药性,其机制可能包括TME中TIL的数量和活动减少，Treg表达增多，多种细胞和免疫调节因子导致的免疫耐受，多种抑制性免疫检查点分子共同促进肿瘤的免疫逃逸等，CPI联合疗法正是通过促进T细胞募集和活化，增加效应T细胞，降低Treg细胞比例，减少TAMS以促进抗肿瘤细胞活性，上调PD-L1和CTLA-4在胰腺癌细胞的表达，减弱TME中的免疫抑制等机制弥补单一疗法的缺陷。尽管早期的临床证据已经开始支持以CPI为基础的联合治疗胰腺癌的可行性和有效性，但到目前为止只有Ⅰ～Ⅱ期试验报道了CPI联合免疫疗法在胰腺癌中的应用。如何克服TME的多重障碍方面；如何确定最佳的联合治疗模式和疗程，如何进一步明确CPI耐药的机制并逆转耐药；如何预测和避免严重不良反应的发生等仍是下一步亟待解决的问题。毋庸置疑，CPI联合治疗给胰腺癌患者肿瘤治疗带来了全新的治疗理念，具有广阔的临床应用前景，相信PC免疫联合疗法的研发将为胰腺癌的治疗带来革命性的改变。