UPLC法分析人参在储存不当情况下对皂苷类成分的影响

张诗雯，张 凡*，高 慧，曹丽娟，姜恒丽

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.盛实百草药业有限公司，天津 300301)

中药在中医治疗中起着重要作用，而不当的贮藏与养护则会影响中药的药效[1]。中药在不当的贮藏过程中，如受不当的温度、湿度、光线、药材自身含水量、包装方式等因素的影响，容易发生一系列质变过程[2-3]。随着中药材市场规模的日益扩大，中药材正确的贮藏与养护变得十分关键，以便其充分发挥药效以及避免发生安全问题[4]。人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根及根茎，味甘、微苦，微温，归脾、肺、心、肾经，可大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智[5]。人参作为我国的名贵中药材，在临床中被广泛应用，但其用量不大且贮存周期长，不当的储存方法会导致人参发生霉变、酸败等现象，进而影响其主要活性成分人参皂苷的含量[6]。因此本实验采用超高效液相色谱的方法，检测人参皂苷Rg1、Re、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量变化，为人参的质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

FA1004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；METTLER AE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；WGL-125B电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；X/WT数显调节仪电热恒温水浴锅(余姚市显星仪器有限公司)；Milli-Q型超纯水制备仪(美国Millipore公司)；Waters ACQUITYTMUPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)。

1.2 材料

生晒参、鲜人参均购自于吉林白山林村盛实百草人参种植基地；人参皂苷Rg1(A0503AS)、人参皂苷Re(S0317AS)、人参皂苷Ro(F0214AS)、人参皂苷Rb1(D0718AS)、人参皂苷Rc(O0303AS)、人参皂苷Rb2(J0322AS)、人参皂苷Rd(D0105AS)，均购于美伦生物有限公司；乙腈、甲醇均为色谱级；其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法

2.1 供试样品制备

2.1.1 霉变人参制备 取未洗的鲜人参适量，不经冷藏直接放置于室温环境一段时间，直至鲜人参表面有白色绒毛斑点生成，每隔7日取出一批霉变的鲜人参，共4批。

2.1.2 酸败生晒参制备 取生晒参适量，用湿抹布包裹，放置于室温环境，放置一段时间后，闻到有酸败气味产生，每隔7日取出一批，共4批。

2.1.3 返软生晒参制备 取生晒参适量，用水浸泡至生晒参变软，取出。

2.1.4 鲜人参 取适量鲜人参，洗净。

2.1.5 生晒参 取适量生晒参，备用。

2.2 对照品溶液制备

分别精密称定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2与人参皂苷Rd对照品适量，用30%乙腈定容，得到浓度分别为0.212 mg·mL-1，0.226 mg·mL-1，0.264 mg·mL-1，0.220 mg·mL-1，0.272 mg·mL-1，0.260 mg·mL-1，0.288 mg·mL-1的对照品溶液。摇匀后用0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

2.3 供试品溶液制备[7]

取鲜人参、霉变人参、酸败生晒参以及返软生晒参适量切成碎末，分别精密称取2.5 g；生晒参打粉，过4号筛，精密称取1.0 g，各供试样品分别用80%甲醇50 mL冷浸提取5次，每次12 h，40 ℃下浓缩提取液至干，用30%乙腈溶解，定容至25 mL容量瓶中，摇匀放置，用前以0.45 μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，4 ℃下低温储藏。

2.4 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C8色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，检测波长：203 nm，流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱，流速：0.4 mL/min；进样量：4 μL。梯度洗脱见表1，色谱见图1。

表1 梯度洗脱程序

A.人参皂苷混合对照品；B.人参供试品

(1.人参皂苷Rg1；2.人参皂苷Re；3.人参皂苷Ro；4.人参皂苷Rb1；5.人参皂苷Rc；6.人参皂苷Rb2；7.人参皂苷Rd)

图1 人参皂苷混合对照品及人参供试品色谱

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下人参皂苷混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8 μL，按照“2.4”项下色谱条件测定，以对照品进样质量为横坐标(x，μg)，峰面积(y)为纵坐标，以外标曲线法，进行线性回归计算。结果表明，各对照品进样量与峰面积在所选定的进样量范围内呈现良好的线性关系，结果见表2。

表2 人参皂苷各对照品线性关系

2.5.2 精密度试验 按照“2.4”项下色谱条件，连续6次吸取混合对照品溶液进超高效液相。实验结果表明，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd的峰面积积分RSD值依次为1.83%、1.33%、1.48%、1.85%、1.44%、1.48%、1.42%。说明该仪器精密度较好。

2.5.3 稳定性试验 按照“2.4”项下色谱条件，精密吸取同一种样品溶液，于放置0、2、4、8、12、24 h后进样，结果表明人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd峰面积积分RSD依次为1.96%、1.67%、1.52%、1.54%、1.78%、1.56%、1.42%。说明样品溶液中的7种成分在24 h内稳定。

2.5.4 重复性试验 同时取出样品6份，每一份精密称取2.5 g，按照“2.3”项下制成样品溶液，按照“2.4”项下方法测定，得到人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd含量RSD值依次为1.50%、2.56%、2.40%、2.31%、2.34%、2.53%、2.11%。结果表明该方法重复性较好。

2.5.5 加样回收率试验 精密称取生晒参粉末0.5 g，共9份，分为3组，精密加入低、中、高三个质量浓度的7个对照品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.4”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果见表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9。

表3 人参皂苷Rg1加样回收率试验

表4 人参皂苷Re加样回收率试验

表5 人参皂苷Ro加样回收率试验

表6 人参皂苷Rb1加样回收率试验

表7 人参皂苷Rc加样回收率试验

表8 人参皂苷Rb2加样回收率试验

表9 人参皂苷Rd加样回收率试验

2.6 含量测定

精密称取生晒参供试品1.0 g，其余各供试品2.5 g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4”项下色谱条件测定，记录7种人参皂苷的峰面积，计算7种人参皂苷的含量。

3 结果

对各人参样品进行测定，得到人参皂苷含量结果，见表10、表11。7种人参皂苷含量变化趋势见图2。结果显示，霉变人参相较于鲜人参，7种人参皂苷含量呈现上升趋势；酸败生晒参、返软生晒参相较于生晒参，7种人参皂苷含量显著下降，其中酸败生晒参下降趋势尤其明显。

表10 鲜人参及不同程度霉变程度鲜人参中7种人参皂苷含量 (mg/g)

表11 生晒参、返软生晒参及不同酸败程度生晒参中7种人参皂苷含量 (mg/g)

图2 7种人参皂苷含量趋势变化

4 讨论

本实验研究发现，当人参发生霉变时，人参皂苷的含量相较于正常鲜人参的含量有所升高。但鲜人参在不当的温度与湿度环境下会引起霉变反应，会导致有毒有害物质产生，对人体产生危害。因此即使在皂苷含量升高的情况上，也应该避免在储存过程中发生霉变。我们可以在人参栽培过程中控制适当的温度以及湿度来使鲜人参中的人参皂苷含量保持相对较高的水平，以保证人参的药效。

在生晒参与返软生晒参以及酸败程度不同的生晒参的对比中，生晒参相较于另外两种贮存不当的生晒参来说，7种人参皂苷含量总和有明显下降趋势，其中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re以及人参皂苷Rb1的含量大幅度降低；且酸败类型生晒参的人参皂苷含量明显低于返软类型生晒参。随着酸败程度的不断加深，人参皂苷的含量逐渐下降。上述实验结果表明，将生晒参储藏在湿度过高或湿度与温度均过高的环境下，会导致生晒参发生返软和酸败现象，使其中人参皂苷含量明显降低。因此在储藏过程中应该避免将生晒参放置于湿度与温度过高的环境中，这样可以使生晒参保持最高的人参皂苷含量，发挥最好的药效，也可避免在变质过程中产生有毒有害成分。

人参作为我国珍贵的中药材越来越受人们重视，随着其栽培与加工技术的不断发展，人参在人们日常生活与临床中得到广泛应用。不正确储藏人参的方式会导致其有效活性成分人参皂苷的含量下降或产生有毒有害成分，使人参不能正确地发挥其滋补强壮以及预防治疗疾病的功效[8]。因此，应该对储藏人参的温度、湿度等环境条件进行强化管理，这样可以避免人参发生质变，从而影响其药材质量[9]。