青海甘蒙柽柳移植木体内黄酮含量及抗氧化性研究

王云云,梁林怀,华燕青,王 磊

(1.杨凌职业技术学院 药物与化工分院，陕西 杨凌 712100；2.国家林业和草原局西北调查规划设计院，陕西 西安 710000 ;3.杨凌绿海植物开发有限公司,陕西 杨凌 712100)

青海省同德县巴沟乡然果村黄河干流的漫滩处有一片甘蒙柽柳“原始野生林地”。该处甘蒙柽柳树龄大，树形奇特，群落具有特殊的生物多样性，对深入研究青藏高原乃至全球气候变化有重要意义。该片甘蒙柽柳林处于黄河羊曲水电站库区内，水电站工程建成蓄水后将会淹没该片柽柳林。通过该研究旨在探索甘蒙柽柳移植木在新环境下生长的适应性和生长质量，为甘蒙柽柳的移植和养护工作提供理论依据。

甘蒙柽柳(TamarixaustromongolicaNakai)为柽柳科(Tamaricaceae)柽柳属(Tamarix)灌木或小乔木，为中国的特有种。为了保护该区域“原始野生林地”的甘蒙柽柳，青海黄河羊曲水电站库区甘蒙柽柳移植保护项目组于2015年4月上旬至2016年4月对该区域内的25株柽柳进行了移植实验，经过30个月的精心养护，所移植的25株甘蒙柽柳生长良好。为了深入研究移植对柽柳树体内化学成分生长的影响情况，2018年10月在原生区和移植区分别采样，利用超声波提取法和邻苯三酚自氧化法，对移植地和原生地甘蒙柽柳的主要成分黄酮的含量变化和抗氧化性变化进行对比研究，从生物学角度来评判移植工作，为项目实施提供理论依据。

1 方法与材料

1.1 仪器

AR2140电子天平，RE-522AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SG2200HE超声波(上海冠特超声仪器有限公司)，UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津)，SHB-3T循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸易有限公司)，酸度计。

1.2 实验材料

甘蒙柽柳样品2018年10月27日分别采于海拔平均2 717 m的原生地(青海省同德县巴沟乡然果村北黄河干流东侧漫滩地)和移植试验区(青海省同德县巴沟乡然果村东侧)。将原生地样品1、2、3和移植地样品1、2、3的枝、叶自然阴干后，分别粉碎过60目筛制粉待用。槲皮素(天津一方科技有限公司)，无水乙醇，正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、ALCL36H2O ，HCl，羟甲基氨基甲烷，连苯三酚，Na2EDTA均为分析纯。

1.3 方法与结果

1.3.1 对照品溶液 精确称取槲皮素对照品10 mg置于50 mL的容量瓶中，加入95%的乙醇溶解稀释至刻度，质量浓度为0.2 mg·mL-1的槲皮素对照品溶液备用。

1.3.2 显色剂溶液 精称AlCl3·6H2O固体 2.0059 g,用95%的乙醇溶解,再加3%的盐酸4～5 mL,用95%乙醇于100 mL的容量瓶中定容。

1.3.3 供试品溶液的制备 取干燥柽柳枝叶粉碎，过60目筛，用50%乙醇超声提取,提取条件为：固液比1∶15；100 W；40℃；40 min;3次，减压浓缩得稠浸膏,悬浮于100 mL 水中,分别用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯和正丁醇萃取，将各萃取液分别减压浓缩，得石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层，分别干燥得干燥粉末。以此为黄酮供试样品。取0.5 g样品粉末,用75%的乙醇溶解，定溶于50 mL容量瓶中，摇匀，用0.22 μm超滤膜滤过，取续滤液用UV测定含量。

1.3.4 最佳吸收波长的确定 取1 mL 槲皮素标准溶液，置容量瓶中，加入5 mL的显色剂，静置显色20 min。同时作两个空白溶液，取1 mL乙醇加5 mL显色剂，静置20 min，用紫外可见分光光度计检测波长。槲皮素标准溶液在427 nm 处有最大吸收峰，且无干扰，故选取此波长作为测定波长。见图1。

图1 槲皮素标准溶液紫外光谱

1.3.5 标准曲线的绘制 移取0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL槲皮素标准溶液，置于10 mL的容量瓶中,加显色剂5.2 mL、5.0 mL 、4.8 mL、4.6 mL 、4.4 mL摇匀，并做阴性对照一个。静置显色20 min。用紫外可见分光光度计在波长427 nm 处测吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.6 抗氧化活性测定 配制 0.1 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷溶液;0.101 mol·L-1HCl溶液; 0.050.1 mol·L-1,pH=7.4,含1 m 0.1 mol·L-1的Na2EDTA Tris-HCl缓冲液； 60 mmol·L-1连苯三酚溶液后，取11.8 mL Tris-HCl缓冲液，加入石英比色皿中，再加约0.2 mL连苯三酚溶液，快速混合，于325 nm处测其吸光度A325nm,30，隔30秒读数一次吸光度A值 ，至300 s止。得A325nm,300的吸光度,△A0= A325nm,300-A325nm,30。取各供试样品续滤液2 mL，加入到大石英比色皿中，再加9.8 mL Tris-HCl缓冲液，再加0.2 mL连苯三酚溶液，混合后测定各样品A325nm,30，每30 s读吸光度一次，至 300 s时为止得A325nm,300。ΔA样=A325nm,300- A325nm,30。自由基清除率=(△A0-△A样)/ △A0* 100

2 结果与讨论2.1 绘制槲皮素标准曲线

由图2可知当槲皮素标准品含量在12.00～27.50 mg·mL-1范围内，与吸光度呈良好的线性关系。回归方程C=11.9263 *A -0.1209 ，r=0.999741。

图2 槲皮素标准曲线

2.2 精密度试验

取同一槲皮素对照品溶液，在波长427 nm处连续测定5次。结果吸光度均值为0.59093，RSD=0.2687%，表明该方法精密度良好。

2.3重复性试验

精密称取干样品5份，分别进行超声提取，照1.3.3项制备5份供试品溶液，于427 nm处测定吸光度值，总黄酮平均值0.8069 mg·g-1, RSD=1.0213%，表明本方法重现性良好。

2.4 稳定性试验

取供试品溶液一份，对照刚做的测定值，分别在0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h测定该样品的吸光度,结果显示吸光度RSD=1.0031%说明样品在显色后2.5 h内稳定性良好。

2.5 加样回收率试验

在已知含量标准品的样品溶液中加入一定的槲皮素对照品溶液后进行测定。结果见表1。

2.6 黄酮含量测定

取原生地和移植地柽柳样品干粉各15 g用50%乙醇超声提取,条件为固液比1∶15；100W；40℃；40 min;3次。减压浓缩得稠浸膏,悬浮于100 mL 水中,分别用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯和正丁醇萃取，将各萃取液分别减压浓缩，得石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层浸膏。分别干燥得干燥粉末见表2。以此为黄酮样品。取一定量样品75%的乙醇溶解，定溶于50 mL容量瓶中，摇匀，用超滤膜滤过，取续滤液为样品溶液。取续滤液1 mL置于试管中加5 mL的显色剂静置20 min，用紫外可见分光光度计测黄酮含量，结果见表3，比较见图3，图4，图5和图6。

表1 加标回收率

表2 取样量及超声提取干粉量

表3 样品中黄酮含量

图3 样品中槲皮素含量 图4 石油醚层槲皮素含量

图5 乙酸乙酯层槲皮素含量 图6 正丁醇萃层槲皮素含量

表4 自由基清除率

2.7 抗氧化活性测定

取2.6项下的各样品续滤液2 mL，加入大石英比色皿中，加9.8 mL Tris-HCL缓冲液，加0.2 mL连苯三酚溶液，迅速混合在325 nm处测定吸光度，每30 s读数一次，至300 s为止。ΔA样=A325nm,300- A325nm,30。各样品黄酮的自由基清除率见表4。清除率=(△A0-△A样)/ △A0* 100。

3 结论

从图3～图6 可见，移植组正丁醇萃取层总黄酮含量较原生组高，各样品间黄酮含量均匀差异较小；石油醚层黄酮含量为：移植组较原生组低，但移植组样品之间黄酮含量差异较小，说明柽柳移植后水分、土壤、环境适宜柽柳生存，长势稳定。乙酸乙酯层中黄酮原生组含量高于移植组，但移植2的含量高于原生组，说明乙酸乙酯层中黄酮类组分受环境因素影响较大，这种影响随个体差异，适应性好的个体不受影响。从表4可见，柽柳中黄酮具有较强的抗氧性。移植组黄酮含量虽然较原生组低，但样品移植1和移植2的抗氧值高于原生组。说明移植对黄酮的含量有影响，而对黄酮的抗氧化性不但没有影响，而且还有利于其抗氧性的积累。

柽柳在移植前对枝条、根系进行了较大的修剪处理，导致树体枝叶的光合作用能力降低，根系的营养吸收活动减弱，致使移植体的整体生长缓慢，整体黄酮含量较原生组低。但是移植组的正丁醇层和石油醚层中黄酮含量较原生组稳定，说明柽柳在缓慢的生长态势下，体内黄酮的蓄积是比较平稳的，且黄酮的抗氧性还在增加，由此说明移植后的生长态势平稳，移植是成功的。