CD276对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响及其初步机制研究

关爱华 蔡 勇 孙 瑜 李万锋

(吉林省肿瘤医院乳腺外科，长春 130012)

乳腺癌在女性恶性肿瘤发病率中位居首位，是严重威胁女性健康的恶性肿瘤。乳腺癌的发生和发展是一个多基因参与、多步骤演进的复杂过程，目前其发病机制尚未完全阐明[1]。肿瘤转移是肿瘤致死的主要原因，因此，预防和抑制肿瘤转移至关重要。

免疫检测点分子是肿瘤免疫学研究的热点之一。CD276属于免疫检查点分子的B7超家族，其在大多数正常组织中低表达，但在各种癌组织，包括乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌等则异常高表达[2,3]，且其高表达与乳腺癌、宫颈癌、肾癌等有较差的预后相关[4-6]。但CD276对肿瘤细胞生物学特性所产生的影响及其确切机制尚不十分清楚。鉴于CD276的表达与肿瘤分级及远端转移相关，推测CD276可能与肿瘤细胞侵袭能力相关。

本文在乳腺上皮细胞系MCF-10A中过表达CD276，在乳腺癌细胞系T-47D中敲低CD276的表达，研究过表达或敲低CD276的表达对细胞迁移和侵袭的影响及其初步的作用机制，从而为阐明CD276的生物学作用奠定基础，以期为乳腺癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1材料 MCF-10A和T-47D细胞系购自上海细胞研究所细胞库，并由本院中心实验室传代培养。CD276真核表达载体pcDNA3-CD276和pRNAT-CD276shRNA(CD276shRNA sequence:5′-GTGCTGGAGAAAGATCAAA-3′)由东北师范大学药物基因和蛋白筛选国家工程实验室馈赠。Snail、Slug和E-cadherin抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司，抗CD276抗体购自RB公司,抗GAPDH抗体购自上海康成生物有限公司，HRP标记的第二抗体购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。PVDF膜购于罗氏公司。预染蛋白分子量标准购于碧云天生物技术研究所。ECL发光试剂盒购自全式金公司。BrdU试剂盒购自Roche Diagnostics (Mannheim，Germany)。细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所。MTT购自Amresco公司。DMEM培养基购自美国Sigma-Aldrich公司。国产新生牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 MCF-10A细胞培养于含10%胎牛血清，100 μg/ml的链霉素和100 U/ml的青霉素的DMEM/F-12培养基中，37℃恒温CO2培养箱中培养传代。T-47D 细胞所用培养基为含10%新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和10 μg/ml 胰岛素的 1640培养基。

1.2.2细胞转染 在转染前一天将MCF-10A或T-47D 细胞培养于6孔细胞板中，24 h后将质粒按3 μg/孔加入到100 μl无血清的DMEM或1640培养基中，充分混匀。然后加入5 μl的转染试剂，混匀，室温静置30 min后，将混合液加入到6孔板中。在含有5%CO2的细胞培养箱中培养4～6 h，然后进行换液。在不同培养时间进行相应的检测。

1.2.3细胞划痕实验 在MCF-10A或T-47D 细胞中分别转染pcDNA3空载体和pcDNA3-CD276重组载体，转染 48 h后，将两组细胞铺于24孔板中，用10%新生牛血清的完全培养液培养16～24 h，使其形成单层细胞，用10 μl移液枪枪头在单层细胞上划痕，用PBS缓冲液清洗3次，洗去漂浮细胞，换成10%新生牛血清的完全培养液继续培养，并分别在0 h、24 h时倒置显微镜下拍照观察细胞生长迁移情况。

1.2.4Transwell 实验 4℃过夜融化基质胶，并用预冷的不含血清的 DMEM 培养基按1∶3稀释基质胶，使其终浓度达到1 mg/ml。将Transwell 小室放置于24孔板上，并加入100 μl稀释的基质胶，37℃孵育 4 h 使胶完全凝固。用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基制备细胞悬液，计数，上室加入 0.5×105个细胞/孔，并在Transwell的下室加 600 μl 正常的 DMEM培养基。将细胞培养板置于37℃，5%CO2孵育箱培养，40 h后从24孔细胞板中取出Transwell小室，PBS洗涤后用4%的多聚甲醛固定细胞30min，PBS 洗 3 次。用棉签除去Transwell小室上未能侵入的细胞。0.5%TritonX-100作用5 min，PBS洗3次；用苏木精对细胞核染色10 min，水冲洗；弱氨水10 s浸泡，水冲洗；伊红细胞质染色3 min，洗净。显微镜下随机选取不同的视野计数。

1.2.5Western blot 将培养细胞用胰酶消化后收集到离心管内，4 000 r/min离心5 min；用PBS洗涤细胞3次，4 000 r/min离心5 min，弃上清，向沉淀中加入适量细胞裂解液冰上裂解，每隔5 min剧烈涡旋20 s，使细胞充分裂解，涡旋60 min后12 000 r/min离心5 min，收集上清至另一新的离心管中，加入适量的蛋白上样缓冲液，沸水浴煮沸8 min，用10% SDS-PAGE电泳，电泳结束后，在100 V恒压条件下将蛋白从SDS-PAGE凝胶转移至PVDF膜上；将PVDF膜用含有0.2%Tween20的TBS缓冲液(TBST)洗涤3次，用含有5%脱脂奶粉的TBST 37℃封闭30 min；TBST洗涤3次后将第一抗体用TBST缓冲液稀释后，与PVDF膜一同装入杂交袋中，4℃过夜；用TBST缓冲液洗涤3次；将HRP标记的二抗用TBST缓冲液稀释后，与PVDF膜一同装入新的杂交袋中，室温摇床上放置30 min或者1 h；TBST缓冲液洗涤3次；最后进行ECL发光检测。

2 结果

2.1CD276在正常乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞中的表达 为了了解CD276在正常乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞中的表达情况，我们利用Western blot方法检测了CD276在乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞中的表达。结果如图1所示，CD276在乳腺上皮细胞MCF-10A中呈低表达，但在乳腺癌细胞T-47D中呈高表达。

图1 CD276在正常乳腺细胞及乳腺癌细胞的表达分析Fig.1 Expression of CD276 in normal breast cells and cancer cells

2.2在乳腺上皮细胞中过表达CD276及在乳腺癌细胞中敲低CD276表达的鉴定 在MCF-10A细胞中分别瞬转pcDNA3.0空载体和pcDNA3.0-CD276真核表达载体，在T-47D细胞中分别瞬转pRNAT空载体和pRNAT-CD276shRNA载体，之后对CD276的过表达及敲低情况进行了鉴定。结果如图2所示，在MCF-10A细胞中瞬转pcDNA3.0-CD276真核表达载体后明显增加了CD276的表达，而在T-47D细胞中瞬转pRNAT-CD276shRNA载体可明显抑制CD276的表达。

图2 CD276过表达及敲低的效果鉴定Fig.2 Identification efficiency of CD276 overexpression and knocking down

2.3CD276对乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞迁移能力的影响 在MCF-10A细胞中分别瞬转pcDNA3.0空载体和pcDNA3.0-CD276真核表达载体，之后进行划痕实验。结果如图3A所示，过表达CD276后明显增强了MCF-10A细胞的迁移能力。在T-47D细胞中分别瞬转pRNAT空载体和pRNAT-CD276shRNA载体，之后进行划痕实验。结果如图3B所示，敲低CD276的表达明显抑制了T-47D细胞的迁移能力。

图3 划痕法检测CD276对细胞迁移能力的影响Fig.3 Effect of CD276 on cell migration was detected by wound healing assayNote:A.Effect of CD276 overexpression on the migration of MCF-10A cells;B.Effect of Knocking-down of CD276 on the migration of T-47D cells.

2.4CD276对乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞侵袭能力的影响 在MCF-10A中分别瞬转pcDNA3.0空载体和pcDNA3.0-CD276真核表达载体，之后进行Transwell实验。结果如图4A所示， 过表达CD276后明显促进了乳腺上皮细胞的侵袭能力。在T-47D细胞中分别瞬转pRNAT空载体和pRNAT-CD276shRNA载体，之后进行Transwell实验。结果如图4B所示，敲低CD276的表达明显抑制了乳腺癌细胞的侵袭能力。

图4 Transwell法检测CD276对细胞侵袭能力的影响Fig.4 Effect of CD276 on cell invasion was detected by Transwell assayNote:A.Effect of CD276 overexpression on the invation of MCF-10A cells;B.Effect of Knocking-down of CD276 on the invation of T-47D cells.

2.5CD276对侵袭相关蛋白表达的影响 在MCF-10A肿瘤细胞中，分别瞬转pcDNA3.0空载体和pcDNA3.0-CD276真核表达载体，于转染48 h后收集细胞， 提取蛋白，通过Western blot方法检测周期相关蛋白。结果如图5A所示，在MCF-10A细胞中过表达CD276可抑制侵袭相关蛋白E-cadherin的表达，促进Snail和Slug的表达。在T-47D肿瘤细胞中，分别瞬转pRNAT空载体和pRNAT-CD276sh RNA真核表达载体，于转染48 h后收集细胞，提取蛋白，通过Western blot方法检测周期相关蛋白。结果如图5B所示，在T-47D细胞中敲低CD276的表达可促进侵袭相关蛋白E-cadherin的表达，抑制Snail和Slug的表达。

图5 Western blot方法检测CD276对细胞中侵袭相关蛋白表达的影响Fig.5 Effect of CD276 on expression of cell invasion related proteins were detected by Western blot analysisNote:A.Effect of CD276 overexpression on the expression of invation related proteins in MCF-10A cells;B.Effect of Knocking-down of CD276 on the expression of invation related proteins in T-47D cells.

3 讨论

乳腺癌是威胁全球女性健康最主要的疾病之一，目前尽管已经开发了更有效的细胞毒性药物、激素和抗Her2治疗乳腺癌的方法，但转移性乳腺癌仍无法治愈[7]，因此仍需要进一步解析乳腺癌转移的机制，以便为乳腺癌提供新的治疗靶点。

CD276属于免疫检查点分子的B7超家族，其在大多数正常组织中低表达，但在各种癌症，包括乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌等组织中明显高表达[5,6]。大量研究表明，CD276过表达与胰腺、乳腺、结直肠、肝脏、前列腺癌、肝内胆管癌、口腔鳞癌的增殖和侵袭潜能相关[8,9]。在许多癌症中，CD276的过表达与较差的预后相关[10,11]。但是，在胃癌和胰腺癌患者中，高表达CD276则与更好的生存率密切相关[12,13]。导致这种差异可能与不同的癌症类型(或亚型)、肿瘤异质性、不同的样本量、临床分期、CD276测定的时间点以及研究中使用的不同方法有关。

转移侵袭是恶性肿瘤的基本特征和重要标志，也是导致患者死亡的最主要原因。研究表明，超过80%的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移。鉴于此，本研究主要着眼于CD276对乳腺癌细胞转移的影响。

肿瘤转移首先表现为细胞迁移和侵袭能力增强。因此，在本文中，我们首先通过划痕法检测了过表达或敲低CD276的表达对细胞迁移能力的影响。结果显示，过表达CD276蛋白可明显增强正常乳腺上皮细胞MCF-10A的迁移能力，而敲低CD276的表达则可明显抑制乳腺癌细胞T-47D的迁移能力。Transwell结果显示，过表达CD276蛋白可明显增强正常乳腺上皮细胞MCF-10A的侵袭能力，而敲低CD276的表达则可明显抑制乳腺癌细胞T-47D的侵袭能力。由此我们推测，CD276可促进细胞的迁移及侵袭，并进而促进肿瘤的转移。

上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transi-tion，EMT)被认为是肿瘤进展和转移的关键步骤[14]。上皮细胞通过EMT获得间充质特性，使肿瘤细胞能够克服内皮屏障，通过血液或淋巴循环向其他器官迁移[15]。在EMT过程中，细胞丢失上皮标志因子，如E-cadherin等，而相关转录因子包括Slug、Twist、Snail等家族会被激活[16]。Snail 家族成员 Snail1 和 Snail2(Slug)等参与了与细胞分化和生存相关的各种过程，对于肿瘤发生起重要作用。Snail 是可直接抑制 E-钙黏蛋白转录的重要因子，可诱导 EMT的发生[17,18]。Snail1 及 Slug 能够抑制 E-钙黏蛋白表达。为了进一步阐明CD276促进细胞的迁移及侵袭的机制，我们通过Western blot方法检测了CD276对E-cadherin、Snail及Slug表达的影响。结果显示，在MCF-10A细胞中过表达CD276可抑制侵袭相关蛋白E-cadherin的表达，促进Snail和Slug的表达；而在T-47D细胞中敲低CD276的表达可促进侵袭相关蛋白E-cadherin的表达，抑制Snail和Slug的表达。

本研究结果提示，CD276蛋白除了在免疫调节中发挥作用，还可通过促进EMT增强乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。本研究可以为进一步研究CD276的功能奠定实验基础，同时也将为乳腺癌转移的治疗提供新的靶点。