调理石斑鱼产品腐败菌的分离及抑菌研究

沈春玉 赵玉巧

摘要 为研究天然防腐剂对调理石斑鱼腐败菌的抑菌效果，对调理石斑鱼的腐败菌进行分离纯化，选择能适应低温环境或能产生芽孢的腐败菌作为试验菌。使用滤纸片法测定乳酸链球菌素、茶多酚、聚赖氨酸对试验菌的抑菌效果，同时采用平板培养法测定天然防腐剂对试验菌的最低抑菌浓度（MIC）。试验结果表明，乳酸链球菌素对7种试验菌都有抑菌效果，茶多酚對5种试验菌有抑菌效果，聚赖氨酸对3种试验菌有抑菌效果。乳酸链球菌素对试验菌中革兰氏阳性菌抑菌效果最好，其中对S-3、S-9、S-11和S-13的MIC分别为0.1、0.4、0.5、0.4 mg/mL;茶多酚对S-3、S-5、S-8、S-10和S-11的MIC分别为0.5、8.0、2.0、0.5、1.0 mg/mL。聚赖氨酸对试验菌S-5、S-8和S-10的MIC分别为2.5、1.5、2.0 mg/mL。

关键词 调理石斑鱼;腐败菌;抑菌;最低抑菌浓度

中图分类号 S 986文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）23-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.054

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Studyon the Isolation and Bacteriostasis of Spoilage Bacteria Bacteria from the Prepared Grouper Products

SHEN Chun yu，ZHAO Yu qiao （College of Marine Life and Fisheries，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang，Jiangsu 222005）

Abstract In order to study the natural preservatives effect on the spoilage bacteria from the prepared grouper products，the spoilage bacteria of the prepared grouper products were isolated and purified，and the spoilage bacteria that can adapt to low temperature environments or produce spores were selected as experimental bacteria.Using filter paper method to determine the antibacterial effect of nisin，tea polyphenols and polylysine on spoilage bacteria.At the same time，the minimum inhibitory concentration （MIC） of natural preservatives against spoilage bacteria was determined by plate culture method.The experimental results showed that nisin had antibacterial effect on 7 experimental bacteria.Tea polyphenol had antibacterial effect on 5 experimental bacteria，and polylysine had antibacterial effect on 3 experimental bacteria.Nisin had the best antibacterial activity against gram positive bacteria in the experimental bacteria，and the MIC for S-3，S-9，S-11 and S-13 were 0.1，0.4，0.5，0.4 mg/mL.The MIC of tea polyphenols on S-3，S-5，S-8，S-10 and S-11 were 0.5，8.0，2.0，0.5 and 1.0 mg/mL.The MIC of polylysine against experimental bacteria S-5，S-8 and S-10 were 2.5，1.5 and 2.0 mg/mL.

Key words Prepared grouper products;Spoilage bacteria;Bacteriostasis;MIC

调理石斑鱼产品以石斑鱼为原料，经过一定加工步骤后，以包装的形式在冷藏（4 ℃）的条件下储存和贩卖，可直接食用或食用前只需要简单加工或热处理。该产品采用低热强度灭菌技术以保证产品良好的风味，但是该技术使产品灭菌不彻底，在储存和贩卖的过程中，产品中残留的细菌就会在适合的条件下生长繁殖，导致产品出现腐败变质现象，限制产品发展。目前，该产品腐败微生物的控制技术成为产品发展的关键问题，而产品腐败菌的分离及抑菌研究是这个问题得以解决的基础[1]。

在控制产品腐败微生物方面，陈佳丽等[2]研究了香辛料对烧鸡中分离的腐败菌的抑制作用;骆琦[3]从烧鸡老汤中筛选了一株耐热芽孢菌，研究了一系列抑菌方法;马含笑等[4]研究了Nisin、聚赖氨酸、单辛酸甘油酯和壳聚糖对腐败酱猪肝中分离出的3株污染微生物的抑制作用;白艳红[5]从低温熏煮香肠中优势腐败菌的角度出发，研制成功了2种复配生物型抑菌剂，延长了低温熏煮香肠货架期。

以上有关产品腐败微生物的分离及抑菌研究方面较少，有关调理石斑鱼产品腐败菌的分离及抑菌鲜见。笔者从调理石斑鱼产品中分离出腐败微生物，靶向选择芽孢菌或能够在低温储藏条件下生长良好的2类影响产品品质关键菌种作为试验菌，体外研究天然防腐剂[6-8]对试验菌的抑菌作用，选出高效天然防腐剂，旨在为调理石斑鱼产品提供防腐理论基础。

1 材料與方法

1.1 材料

石斑鱼（连云港三开食品有限公司）;乳酸链球菌素（浙江银象生物工程有限公司）;茶多酚（万利达生物科技有限公司）;聚赖氨酸（河南万邦实业有限公司）。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基[9]和芽孢培养基[10]。

1.2 方法

1.2.1 石斑鱼预处理。将新鲜程度不同的原料石斑鱼分成2组，新鲜度如表1所示，第1组去鳞、去腮、去内脏（“三去”）后立即取鱼肉部分培养;第2组“三去”后油炸、包装，30 ℃加速培养3 d。

1.2.2 调理石斑鱼腐败微生物的分离和初步鉴定。

使用平板计数法分离调理石斑鱼腐败微生物，根据肉眼观察菌落形态、菌落颜色、隆起状态、边缘和表面状态，挑选出存在差异的菌落[11]，将其编号并且记录形态、颜色、状态等。对挑选出的菌落进行革兰氏染色和芽孢染色[9]的初步鉴定。

1.2.3 不同温度下腐败微生物的生长。

将腐败微生物接入牛肉膏蛋白胨培养基，分别置于5、10、15、20 ℃温度下培养，观察10 d内菌株生长情况。

1.2.4 菌悬液的制备。

从菌种保藏斜面上取适量菌，研磨洗入15 mL无菌生理盐水中，振荡均匀，菌悬液浓度为107 CFU/mL。

1.2.5 滤纸片法抑菌试验。配制5 mg/mL的乳酸链球菌素、茶多酚、聚赖氨酸溶液，现配现用。同时配制相同浓度的3种溶液，于121 ℃灭菌20 min后使用。

将灭菌后的Φ6 mm滤纸片置于防腐液中浸泡5 min，贴于涂有0.1 mL菌悬液的细菌平板上，同种菌株做2组平行样。将平板置于30 ℃培养箱培养48 h后取出，测量抑菌圈大小。

1.2.6 乳酸链球菌素MIC的测定。

配制含乳酸链球菌素浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL的牛肉膏蛋白胨培养基，灭菌后倒30 mL该培养基于含有菌悬液的平板中混合均匀，每个菌株做2个平行，将平板放入30 ℃培养箱培养48 h后，观察菌株生长情况，将没有菌生长的该乳酸链球菌素浓度牛肉膏蛋白胨培养基作为MIC。

1.2.7 茶多酚MIC的测定。

配制含茶多酚浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/mL的牛肉膏蛋白胨培养基，试验方法同“1.2.6”。

1.2.8 聚赖氨酸MIC的测定。

配制含聚赖氨酸浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/mL的牛肉膏蛋白胨培养基，试验方法同“1.2.6”。

2 结果与分析

2.1 调理石斑鱼腐败微生物菌落形态

从图1所示的菌相中挑选出13种腐败微生物，菌落形态结果如表2所示，S-1～S-12为第1组预处理石斑鱼中挑选出的菌落，S-13为第2组加速培养油炸石斑鱼中挑出的菌落。

将这13种菌落划线分离纯化，得到单菌落形态与初始记录相符合，对其进行初步的革兰氏染色、芽孢染色及镜检[12]。图2分别是编号为S-5号和S-10号的菌种划线分离单菌落形态图。

2.2 腐败微生物菌种的镜检结果统计

13种腐败微生物镜检结果统计如表3所示，其中球菌较多，S-13能够产生芽孢。有资料显示[13-14]，大部分芽孢杆菌产生的芽孢抵抗性较强，耐高温，能够在较高温度下存活，是导致灭菌食品腐败变质的主要原因，且有些芽孢杆菌会在食品中产生毒素，从而造成腹泻、呕吐等不良症状。选择S-13为抑菌试验菌株。

2.3 不同温度下腐败微生物生长结果

由表4可知， S-3、S-5、S-8、S-9、S-10和S-11能够在5 ℃良好生长。由于调理石斑鱼产品的储藏和运输条件为4 ℃左右，因此能够在5 ℃左右生长良好的菌种会在储藏和运输过程中导致调理石斑鱼产品的腐败变质[15]。故将该6种能够低温生长的菌种选为部分试验菌。

2.4 天然防腐剂的抑菌效果

由表5可知，乳酸链球菌素对S-3、S-9、S-11和S-13抑菌圈大，对S-5、S-8、S-10抑菌圈较小，结合表2结果说明乳酸链球菌素对革兰氏阳性菌抑菌效果极好，对革兰氏阴性菌抑菌效果不明显，这与他人研究的乳酸链球菌素对革兰氏阴性菌几乎无抑菌效果的结果相符合[16]。茶多酚对S-3、S-10和S-11也有较大的抑菌圈，对S-5和S-8的抑菌圈小;聚赖氨酸仅对S-8有较大的抑菌圈，对S-5和S-10的抑菌圈小。比较三者，乳酸链球菌素对试验菌抑菌谱更广，属于高效天然防腐剂，茶多酚其次。

2.5 高压灭菌处理对天然防腐剂抑菌活性的影响

将表6与表5对比可知，表6中乳酸链球菌素的抑菌圈比表5小很多，高温处理乳酸链球菌素不稳定，降低了其对试验菌的抑菌效果;茶多酚的抑菌圈大小稍有变化，说明其热稳定性一般;聚赖氨酸的抑菌圈大小几乎无变化，说明聚赖氨酸具有热稳定性[17]。

2.6 乳酸链球菌素MIC的测定

从表7可以看出，乳酸链球菌素对S-3的MIC为0.1 mg/mL，对S-9的MIC为0.4 mg/mL，对S-11的MIC为0.5 mg/mL。继续增加乳酸链球菌素浓度会超过食品添加剂最大允许添加量，而且乳酸链球菌素对革兰氏阴性菌抑菌效果不好，故未对S-5、S-8、S-10进一步测定MIC。乳酸链球菌素对该研究试验菌的MIC均高于吕志飞等[18]研究的乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌的MIC，是因为菌种及研究方法不同，该研究以平板中是否生长菌为标准测定MIC比液体培养测OD值法更为可靠。

2.7 茶多酚MIC的测定

从表8可以看出，茶多酚对S-3和S-10的MIC为0.5 mg/mL，对S-5的MIC为8.0 mg/mL，对S-8的MIC为2.0 mg/mL，对S-11的MIC为1.0 mg/mL。与李柯欣[19]研究结果的茶多酚对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的MIC分别为0.25、8.00、10.00 mg/mL相差不大。由于茶多酚对试验菌的MIC均超过食品添加剂最大允许添加量，在后续研究中可配合其他高效防腐剂应用于产品，降低其使用量。

2.8 聚赖氨酸MIC的测定

从表9可以看出，聚赖氨酸对S-5的MIC为2.5 mg/mL，对S-8的MIC为1.5 mg/mL，对S-10的MIC为2.0 mg/mL。有研究报道称[20]，聚赖氨酸作为一种天然防腐剂，抑菌谱广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌以及霉菌等都有较好的抑制作用。其抑菌谱虽广，但也不能全部抑制，其能抑制的调理石斑鱼产品中试验菌较少，故后续不考虑其在调理石斑鱼产品中的应用。

3 结论

由于石斑鱼生长环境温度低，其携带的微生物也适宜低温生长，且石斑鱼营养丰富，鱼体捕捞死亡后，其携带微生物迅速繁殖，因而从调理石斑鱼中挑选出的13种腐败微生物中，能够低温生长的菌株占比较多。挑选出的7种试验菌产芽孢或能够在5 ℃生长的特性，使得这7种腐败菌在调理石斑鱼产品生产和储存过程中占有优势，极易引起产品腐败，影响产品发展。

天然防腐剂体外抑菌试验表明，乳酸链球菌素对试验菌具有广谱抑菌性，乳酸链球菌素对革兰氏阳性菌试验菌S-3、S-9、S-11和S-13的MIC分别为0.1、0.4、0.5、0.4 mg/mL，都在食品添加剂最大添加范围内;茶多酚对抑菌效果紧随其后，对试验菌S-3、S-5、S-8、S-10和S-11的MIC分别为0.5、8.0、2.0、0.5、1.0 mg/mL;聚赖氨酸抑菌效果最差，对试验菌S-5、S-8和S-10的MIC分别为2.5、1.5、2.0 mg/mL。选择乳酸链球菌素和茶多酚这2种高效天然防腐剂做后续研究。

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