免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离鉴定方法

严井学 （河北省遵化市刘备寨乡畜牧兽医站 064200）

伪狂犬病毒(PRV)，其特性为可以感染多种群体，不同种群之间也可相互传染，致使其在发病后的影响范围较大，极难控制。部分PRV呈现隐性感染的特征，虽然不会表露出明显的染病特征，但病毒会长期携带，很可能产生大范围传播的问题。一些欧洲国家希望通过血清学诊断的方式进行病毒监测，以便于达成及时根治病毒的目的，然而由于部分野生动物也是该类病毒的携带者，属于重要的传染源，致使此类病毒的根治难度加大。现就其分离鉴定方法作一介绍。

1 分离鉴定方法

1.1 材料 从表现出伪狂犬病症状频临死亡的仔猪中提取心、肝、肺、脾等重要脏器，经过冻融处理后，采取研磨离心的方式，得出溶液，将最上层的溶液提取后保存，并且细致标注好溶液来源。之后根据试验要求，合理选择试剂与血清，所选用的试验材料包括：LA Taq DNA聚合酶、DNA提取试剂盒、胎牛血清、DMEM培养基、PRVBarthak61疫苗株阳性猪血清以及小白鼠；引物分别为gB up/gB down和gE up/gE down，主要作用为检测PRV病毒[1]。

1.2 病毒的分离和纯化处理 首先将经过前期处理的研磨液过滤，得出0.22μm的溶液，之后在其中添加接种单层细胞，在37℃的环境下持续孵育1h后，将其中的接种液去除，再将浓度为2%的培养液加入其中，在培养箱中进行培养操作，并且查看其细胞病变状况。当发现其中有超过70%的细胞发生病变后，便可收毒，经过冻融处理后，提取上层的清液，之后借助Vero细胞进行再次处理。将上述操作获得的溶液进行DNA检测，并且使用引物对其进行检测。

1.3 鉴定方法 将分离得到的病毒进行接种处理，将其放置于Vero细胞中持续培养36h，将其中的培养液去除，将经过预冷处理的乙醇添加至上述所得物质中，在其中添加被稀释处理的HeN1株阳性猪血清和Barthak61株阳性猪血清，将添加量控制在1ml，将其置于37℃的空间内孵育1h。之后借助PBS洗涤处理，并且使用显微镜观察细胞核的变化状况[2]。

1.4 动物试验法 将小鼠分为2组，分别进行接种分离病毒稀释液和PRVS株，为研究不同稀释度对病毒状况的影响，选用不同的稀释度的病毒进行注射，一般会在小鼠的腹股沟位置进行皮下注射。第2组采取同种注射方式，接种之后，对小鼠的生长状况和临床表现进行细致记录与分析，结合专业的算法，得出病毒的致死量。

2 结果判定

2.1 病料测定 进行仔猪组织浆液的冻融处理后，对于其中提取的浆液进行DNA检定，之后使用特异性引物进行检测。通过对比检测结果可知，在众多组织浆液中，仅有脑部的组织样品与阳性片段相似。这就代表其中的被检测对象中，存在脑部病毒感染的问题。整体分析所选用的研究对象所处的养殖场在进行疫苗接种时，缺失gE基因，可以认为其感染的病区为PRV毒株。

2.2 病毒分类 在对研磨液进行一系列的处理后，对其中的细胞变化状况进行观察，其主要变化形式为，出现细胞聚集表现后，呈现出变圆或者脱落的现像，还有部分形成合胞体。从中提取DNA后，进行病毒检验，同时借助引物对其特异性片段进行对比分析，其片段表现出扩增的现像，为此可以认为其病料中存在PRV病毒感染的现像。

3 结论

有时候虽然养殖场进行了接种防疫，但由于病毒中的流行菌株发生了一定的转变，致使PRV疫苗无法发挥其自身的病毒防控作用，仔猪染病现像难以控制，这无疑会对养殖事业的发展带来较大影响。因此，要求在后续发展中，应不断深入研究PRV病区的流行株变化规律，形成更为有效的防疫方法，控制伪狂犬病毒的传播与影响。