脓毒血症中的心脏自噬

叶冰洁，宋志

作者单位：1 518000 深圳,深圳市深圳大学总医院重症医学科

脓毒血症是全世界重症监护病房患者的主要死因[1]，表现为一种致命的器官功能障碍，由宿主对感染的反应引起[2]。脓毒症已成为一个主要的公共卫生问题，患者常合并慢性并发症，严重降低生活质量并给社会及家庭造成严重影响和负担。目前脓毒症的治疗仍是支持性治疗，大多数基于分子的治疗在临床尝试中都失败了[3,4]。探索新的治疗干预措施以促进这种破坏性临床疾病的治疗，迫在眉睫。

心功能不全是脓毒症引起多器官衰竭的一个严重组成部分，过度炎症包括代谢和β-肾上腺素能反应受损被认为是潜在因素[5]，脓毒血症引起心肌病的病理生理机制已成为研究的重点。线粒体约占心肌细胞体积的30%[6]。研究表明，脓毒血症会导致线粒体结构和功能受损，这种异常不仅使能量供应不足，还会造成线粒体衍生的危险信号分子（DAMPs）过度产生，如活性氧簇（mtROS）、线粒体DNA碎片（mtDNA）、N-甲酰肽、心磷脂、ATP、线粒体转录因子A和细胞色素C。这些有害分子会加剧脓毒血症期间的心肌炎症，造成继发性心肌病[7-9]。

最近研究揭示了自噬在胚胎发生、发育、细胞死亡和免疫中充当新的角色，并且自噬功能障碍和疾病间的密切相关[10-12]。自噬对许多疾病有着双重作用，其有助于细胞对代谢和炎症的调节。在正常生理情况或轻度打击下，自噬具有适应性，促进细胞存活；在严重和长期打击下，引起过度自噬活动和自噬不足，导致大量细胞质自身降解和有毒物质的积累，这些结果中的任何一种都是适应不良的表现，最终导致细胞死亡。研究表明，脓毒血症会引起包括心脏在内的多个器官的自噬。自噬的调节可作为治疗脓毒血症的新策略。脓毒血症相关的自噬增加是一种清除受损蛋白质和细胞器的溶酶体依赖过程。越来越多证据表明脓毒血症可引发包括心脏在内的多个器官的自噬[13-16]。

1 脓毒血症期间自噬动态变化

自噬控制细胞的质量，促进细胞存活，在生理反应或轻度压力下，它是适应性的。但在严重或慢性打击下，过度或不充分的自噬会导致大量的自我降解或有毒物质积累；这两者都是不适应性的，最终致细胞死亡[17]。例如无论是小鼠的盲肠结扎穿刺（CLP）脓毒血症在体模型还是脂多糖（LPS）培养的心肌细胞体外模型都表明，刺激自噬可以保护心肌，表明自噬对心肌细胞具有保护作用，是一种适应性反应。相反，通过自噬抑制剂直接减少自噬，或通过抗氧化剂间接减少自噬，可改善脂多糖诱导的脓毒血症小鼠的心肌收缩力，从而支持自噬适应不良的结论[18]。这些观察结果的差异可能是由于实验环境、脓毒症的严重程度、药物特异性及给药时间的不同造成。

最近一项研究表明，心脏自噬随着脓毒血症的严重程度发生动态变化。该研究检测了LPS诱导脓毒血症小鼠心脏组织自噬反应的程度，发现LPS触发了剂量依赖性自噬反应[19]。当低剂量给予LPS时，模拟轻度脓毒血症模型，自噬与损伤程度成比例增加。而在严重脓毒症的情况下，这种能力与损伤的严重程度成比例下降。此外还发现，大剂量LPS诱导下的自噬失败与mTOR信号的激活和临床体征的出现有关，表现为心功能下降、炎症指标升高和心肌组织受损。这些心脏自噬的观察结果与肝脏自噬报告一致，显示在脓毒血症的早期阶段自噬增加，随后在小鼠CLP脓毒血症模型的晚期器官衰竭阶段减少[20]。在轻度脓毒血症或脓毒血症的初期阶段，自噬是适应性的，促进细胞生存、维持器官的正常功能。当脓毒血症进展到严重情况时，自噬反应变得不充分，导致自噬适应不良。

mTOR通路是一个抑制自噬的经典上游节点[21]。低剂量LPS组小鼠心脏的mTOR复合物激活状态明显降低。高剂量LPS引起的自噬减弱明显与mTOR的激活有关[19]。结果表明，在脓毒血症的严重阶段，mTOR的激活抑制有益的自噬活动。虽然mTOR长期以来被认为是控制自噬活动开启和关闭的常规调节开关，但最近研究发现，许多自噬刺激通路的作用不涉及mTOR。这类信号包括细胞内肌醇-IP3途径、Ca2+-钙质途径、通过cAMP（Epac）-PLCε-IP3途径激活的cAMP交换蛋白、富含亮氨酸的重复激酶2和海藻糖等[22]。

2 Beclin-1依赖性自噬在脓毒血症期间对心脏的保护

Beclin-1是最早发现的哺乳动物自噬效应物之一。这种蛋白普遍表达，Beclin-1基因的纯合子缺失导致早期胚胎死亡。Beclin-1通过与PtdIns(3)-激酶的相互作用发挥自噬起始因子的作用。这一蛋白复合物共同启动自噬的关键步骤，并参与自噬体与溶酶体融合的后续步骤[23]。

用心脏特异性Beclin-1过表达和杂合子缺乏的办法来使转基因小鼠体内的Beclin-1增加和减少。Beclin-1的过度表达减轻了心脏炎症和纤维化损伤，保护了线粒体，最终改善了脂多糖对心脏的损害。在高剂量的LPS刺激下，Beclin-1的过度表达使心脏中mTOR的激活减弱[19]。由于mTOR的激活与自噬活性呈负相关，因此，即使在严重脓毒血症的情况下，增强beclin-1信号可以抑制mTOR的激活，维持自噬。同时还观察到，AMP激活蛋白激酶（AMPK）和UNC-51样自噬激活激酶1（ULK1）的Beclin-1依赖性激活。研究者普遍认为，mTOR通过抑制ULK1（一种在beclin-1上游起作用的自噬激活激酶）来抑制自噬[24]。上述研究表明在对抗脓毒血症中，Beclin-1可能通过增强心脏中AMPK和ULK1的表达来参与自噬的正反馈调节。

在小鼠CLP脓毒血症模型中，一氧化碳治疗的研究也提示了Beclin-1介导的脓毒血症保护作用[25]。敲除Beclin-1可消除CO减轻炎症的有益作用。Beclin-1也是巨噬细胞增强吞噬功能所必需的，因此，Beclin-1对脓毒血症的保护并不局限于心脏。然而，在脓毒血症的病理条件下，Beclin-1在各种细胞和组织中的调节作用仍有待进一步研究。

3 Beclin-1对心肌线粒体的依赖性保护作用

脓毒血症引起线粒体损伤，加重心肌炎症和心脏功能障碍程度[26]。脓毒血症时，脂多糖会破坏线粒体结构，损害代谢功能，并将mtDNA片段释放到心脏组织的细胞液中。LPS激发后线粒体损伤的这些表现，在具有Beclin-1过度表达的转基因小鼠心脏中被减弱，表明Beclin-1在脓毒血症中对心肌线粒体的保护具有关键作用[19]。

功能失调的线粒体可通过自噬得以恢复[27]。事实上，Beclin-1的过度表达导致心脏组织中更多的线粒体/溶酶体形成，Beclin-1介导的脓毒血症期间心脏线粒体的质量控制有望成为上调线粒体自噬的产物[19]。一种途径受PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）和E3泛素连接酶Parkin调节，后者以膜电位丢失的线粒体为靶点，随后将这些线粒体带到自噬体进行降解[28]。或者，线粒体自噬通过外部线粒体膜（OMM）定位的受体（如BNIP3L/NIX，BNIP3和FUNDC1）启动，这些受体将线粒体与自噬体联系起来[29]。并非所有线粒体自噬都是相同的，激活线粒体自噬的信号分子有选择地响应不同刺激。在应对LPS时，Beclin-1刺激线粒体自噬，PINK1和Parkin选择性地向线粒体聚集，同时强烈抑制受体蛋白BNIP3L和BNIP3。这些数据表明Beclin-1通过选择性激活特定的线粒体自噬途径来保护线粒体，而不是大量诱导所有类型的线粒体自噬。该研究还支持PINK1-Parkin线粒体自噬在脓毒血症期间具有心脏保护作用，是一种适应性反应[30]。

Beclin-1是否和如何通过PINK1信号转导途径来进行线粒体自噬尚不完全清楚。几项研究表明，PINK1通过磷酸化的线粒体融合蛋白2（Mfn2）将Parkin聚集到受损的线粒体中。在上述脓毒血症的动物模型中，使用western blotting技术，在Beclin-1过度表达的小鼠心脏组织中未检测到Parkin或Mfn2磷酸化。值得注意的是，在蛋白靶点过度表达的细胞中检测到磷酸化的Parkin或Mfn2[31]。目前的方法在检测体内磷酸化PINK1、Parkin和MFN2的生理表达含量方面可能有局限性。推测Beclin-1激活的PINK1-Parkin线粒体自噬的刺激可能涉及线粒体相关膜（MAMs）。MAMs是一种特殊的亚细胞结构域，它将线粒体与内质网（ER）连接起来，对线粒体至关重要[32]。Beclin-1被发现与Parkin相互作用，这种联系对于PINK1-Parkin线粒体自噬的进展是必需的[33]。因此，当Beclin-1信号上调时，PINK1-Parkin线粒体自噬途径更易被激活。

除了通过线粒体自噬去除受损线粒体外，Beclin-1还可通过上调PINK1/parkin和/或AMPK/ULK1来促进线粒体的生物发生[34]。最近研究表明，Parkin可通过蛋白酶体降解底物PARIS（一种锌指蛋白）高效调节线粒体的生物发生[35]。迄今为止，是否利用类似的机制来调节脓毒血症心脏的线粒体仍有待进一步研究。

Beclin-1抑制BNIP3信号的机制有待确定。与PINK1-Parkin的功能相似，BNIP3在线粒体中也起着双重调节作用。通过缺氧诱导因子1和FOXO3a和/或通过ROS的翻译后氧化来调节转录[36]。激活时，BNIP3促进线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放，聚集LC3形成自噬体，并启动线粒体自噬[37]。这种蛋白会导致线粒体功能障碍，随后在应激条件下通过激活下游效应器Bax/Bak诱导细胞死亡[38]。在心肌中既能观察到BINP3诱导的自噬，又能观察到线粒体损伤[39]。进一步发现，FOXO3a转录上调的BNIP3使得线粒体膜电位降低，线粒体Ca2+增加，导致线粒体断裂和心肌细胞凋亡[36]。因此，BNIP3的积累对线粒体的影响是其双重作用平衡的结果。在脂多糖干预小鼠的心脏中，线粒体BNIP3的增加可能加重有害的线粒体缺乏，而诱导的自噬又不足以清除受损的线粒体，Beclin-1可能具有削弱BNIP3信号的控制作用[19]。BNIP3信号在缺氧和缺血/再灌注条件下产生病理反应，然而，BNIP3在脓毒血症引起的心脏功能障碍中是否具有病理性以及Beclin-1如何与BNIP3相互作用需要进一步研究。虽然Beclin-1选择性地促进PINK1-Parkin线粒体自噬以清除受损的线粒体，但Beclin-1也通过PINK1/Parkin以及AMPK/ULK1促进线粒体生物发生。当Beclin-1信号增强时，这些效应共同作用，维持脓毒血症期间线粒体的功能。相反，在脓毒血症的打击下，当Beclin-1的信号不充分时，更强的线粒体BNIP3信号和AMPK、ULK1的低水平激活以及强烈的炎症反应加剧心脏线粒体的恶化。

4 脓毒症期间心脏功能障碍的线粒体自噬和炎症

自噬通过限制炎症激活物和通过线粒体自噬来减少线粒体DAMPs控制炎症。另一方面，在某些严重或长期打击下，自噬的增加可能会加剧由于细胞成分不受管制的降解而形成不必要的结果，导致毁灭性炎症[40]。线粒体和线粒体自噬对炎症调节的影响近年来受到了广泛关注。我们发现胞浆mtDNA与细胞内TLR9结合并激活炎症因子NF-κB，也刺激了DNA传感器cGAS，促进了STING-IRF3依赖性途径[41]。线粒体自噬被认为是消除线粒体功能紊乱，减少线粒体DAMPs（如mtDNA）的有效途径。

先前研究表明，脓毒血症和创伤性的心脏炎症，至少是由toll样受体4（TLR4）/CD14复合物的激活和线粒体DAMPs的增加介导的。在脂多糖诱导的脓毒血症模型中，增加Beclin-1依赖性自噬可改善心脏预后并减少细胞因子的产生[20]。然而，这种益处也有一定局限性，对于高剂量LPS（10 mg/kg）的反应，即使自噬活性被显著提高了，Beclin-1过度表达的小鼠仍会发生毁灭性炎症反应。炎症仍是小鼠心脏功能障碍的一个主要原因。此外，不能排除自噬增加本身可能导致心力衰竭的可能性。自噬和炎症间的信号交叉在各种疾病发展过程中动态演变[40]。

5 基于自噬的脓毒症治疗机会

目前以自噬为基础的治疗方法尚未用于临床。尽管某些经FDA批准的药物，如雷帕霉素、氯喹和二甲双胍具有激活或停止自噬的作用，但它们并不是为了调节自噬而研发的，并且这些药物在体内具有广谱的影响。例如，雷帕霉素是mTOR（一种负性调节自噬的丝氨酸/苏氨酸激酶）的抑制剂。mTOR也参与了自噬以外的功能，如蛋白质转换、新陈代谢、能量平衡和应激反应[42]。迄今为止，脓毒血症如何引发自噬反应的途径还不清楚。未来这一领域的研究成功将大大促进新的药理学干预措施的发展，特别是针对自噬因子，这可能成为一个大大的对抗脓毒血症的好方法。

近年来，新出现的药物研发工作已与自噬机制的调节因素脱节。自噬诱导疗法的一个重大进展是发现了一种细胞通透性Beclin-1激活肽，即Tat-Beclin-1肽（TB肽）。TB肽含有Beclin-1的BARA结构域的18个氨基酸，通过竞争性地将内源性Beclin-1结合到其负调节因子高尔基体相关植物致病相关蛋白1来诱导自噬，这种肽在与减少病毒感染中显示出治疗益处，在压力超负荷时改善心脏功能，并增强化疗的有效性[43]。研究还发现了三种具有自噬诱导物特征的新型小分子，这些分子阻断了beclin-1与其下游抑制剂Bcl2的结合，从而刺激自噬[44]。

给予LPS诱导的脓毒血症小鼠结核肽，能显著改善小鼠心功能，减少循环细胞因子，尤其是TNF-α、IFN-γ、IL-17α和IL-6。作用机制是通过直接靶向刺激Beclin-1介导的，为评估该药物在脓毒血症中的治疗潜力提供重要依据。

6 总结

自噬在脓毒血症引起的器官功能障碍的病理过程中起着重要作用。多项表明，自噬在脓毒血症的进展过程中发生着动态变化，脓毒血症后期自噬不足且适应不良。这种缺陷与mTOR信号的上调有关，细胞内去除功能失调的细胞器和有毒物质导致大量的DAMPs积聚。特异性靶向自噬因子为脓毒血症的治疗提供了一个新的机会。