《结核病患者外周血淋巴细胞亚群检测及临床应用专家共识》解读

梁建琴 吴雪琼

结核病是威胁全球公共卫生健康的传染病之一。人类感染结核分枝杆菌后，大部分呈潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)状态。LTBI者中只有5%～10%存在终生罹患活动性结核病的风险[1]，而机体的免疫抑制进一步增加了这种风险。这说明宿主先天免疫应答和适应性免疫应答在结核病控制中的重要作用。因此，对结核病患者免疫状况的评估、了解其临床免疫学特征是近年来研究的热点之一。临床上评价患者免疫状况的实验室检测项目主要是外周血淋巴细胞亚群和细胞因子水平。为此，《中国防痨杂志》编辑委员会、中国医疗保健国际交流促进会结核病防治分会基础和临床专业学术部组织专家共同拟定《结核病患者外周血淋巴细胞亚群检测及临床应用专家共识》(以下简称《共识》)[2]，全面介绍了我国结核病临床诊疗常用的淋巴细胞亚群分析项目及其对检测结果的正确判读与分析；明确了结核病患者检测淋巴细胞亚群的用途，提出了可供临床借鉴的具体建议；并对未来淋巴细胞亚群检测的发展前景进行了展望。笔者就《共识》中淋巴细胞亚群检测的标准化，以及临床如何正确客观分析检测结果进行解读，以供我国结核病临床工作者借鉴和参考，指导临床正确评估患者的免疫状态，以便实施个性化的免疫干预措施。

关注淋巴细胞亚群检测方法的标准化和规范化

流式细胞术(flow cytometry，FCM)淋巴细胞亚群分析是一项操作相对复杂的技术，集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，具有分析和分选细胞的功能。20世纪90年代，美国疾病预防控制中心(Centre for Disease Control and Prevention, CDC)、美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI)[原名为：美国临床实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS)]出台了FCM淋巴细胞亚群分析的标准化方案[3-4]。此后，随着FCM仪器和试剂的不断更新，这些标准化方案也得到了进一步完善。我国FCM在操作程序、质量控制(简称“质控”)、试剂和仪器选择、结果参考范围等方面存在许多问题，为此，原中华人民共和国卫生部于2011年12月14日发布了中华人民共和国卫生行业标准《WS/T 360—2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》[5]。《共识》中的外周血淋巴细胞亚群检测方法即是参考该指南执行的。淋巴细胞亚群分析是检测机体免疫功能的重要指标。在免疫应答期间，外周血T淋巴细胞发育为功能不同的亚群，并通过分泌特殊的细胞因子，影响细胞免疫，调节体液免疫应答。影响外周血淋巴细胞亚群检测结果的因素很多，和任何一项检测技术一样，必须严格执行检测操作程序和检测方法的标准化和规范化，包括标本采集、仪器设备的校准维护和正确使用、试剂质量检测、操作人员的培训、严格的室内和室间质控、结果报告解释、质控对照的设置等。《共识》明确指出检测的注意事项，尤其强调了报告结果的参考值范围。参考值范围是医学上常用的给临床诊断提供明确的数值依据，医务人员以此作为诊断疾病的标准，对指导临床治疗意义重大。虽然少数地区的流式细胞室自己建立并统一了淋巴细胞亚群检测结果的参考值范围，但绝大多数区域的流式细胞室所采用的参考值范围都是引用文献，或由仪器生产厂家直接提供，而且不同的流式细胞实验室之间所采用的淋巴细胞亚群参考值范围还存在一定的差异。不同厂家的仪器和试剂、环境和患者因素都会对结果影响很大，尤其是绝对计数的参考值范围受性别、年龄、种族、营养和环境差异的人群、仪器类型及试剂来源的不同而存在差异[6-10]。从《共识》检测报告内容的图1可以看出，淋巴细胞亚群的绝对计数参考值区间范围较大，比如，总T淋巴细胞绝对计数为955～2860个/μl，也从一个方面说明FCM淋巴细胞亚群分析结果的影响因素较多。为了确保诊断的准确性，不漏诊不误诊，指导临床有针对性地采取干预措施，建议各实验室需针对不同型号的仪器和不同厂家的试剂合理配套应用，建立区域人群淋巴细胞亚群结果的参考值范围及评价体系，男性和女性、成人和儿童应分别建立参考值范围[11-12]。力争实现区域性淋巴细胞亚群检测方法的标准化和规范化。

重视结核病患者外周血淋巴细胞亚群检测的临床应用

淋巴细胞亚群是一群表型多样，功能复杂并存在复杂调控机制的细胞群[13]，反映了机体的免疫功能，与疾病的发生、发展和转归关系密切。T细胞主要参与细胞免疫，表达CD3抗原，其中，T细胞又包括辅助T细胞(Th)和抑制T细胞(Ts)，它们分别表达CD4和CD8抗原；B细胞主要参与体液免疫，表达CD19抗原；自然杀伤细胞(NK细胞)表达CD16和(或)CD56抗原，在机体中不依赖抗原刺激而自发地发挥细胞毒效应。《共识》具体提出7类活动性结核病患者要进行外周血淋巴细胞亚群检测，而且要在治疗前后进行检测结果的比较，即老年患者、复治和久治不愈的患者、病变范围广泛严重的患者、并发严重感染尤其是HIV感染/AIDS的患者、并发糖尿病的患者、并发肿瘤和严重营养不良的患者、并发免疫抑制或有免疫缺陷家族史的患者。通过对不同亚群淋巴细胞相对计数、绝对计数的分析，可以评估结核病患者的免疫状况，及时实施干预措施，监测治疗效果。《共识》通过检索复习文献指出，老年结核病患者CD3+、CD4+、CD8+、自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT细胞)和B淋巴细胞绝对计数显著低于中青年结核病患者，而NK细胞无明显降低[11,14]，说明老年患者的适应性免疫功能较差，而固有免疫功能没有明显降低，这直接影响了老年患者的治疗效果和治愈时间。临床可通过应用免疫增强剂提高老年患者的免疫力，辅助控制老年结核病。复治、耐药、病情严重的肺结核患者淋巴细胞亚群的各项检测值均较低[15-18]；有学者报道， CD4+和CD8+T细胞、B细胞在单肺病变组高于双肺病变组[16, 19]，与其治疗效果差、痰菌转阴慢、病情迁延有密切关系，可通过免疫治疗促进病情恢复。研究表明，糖尿病并发结核病患者CD8+T细胞和B细胞绝对计数降低，NKT细胞相对计数和绝对计数显著增高。糖尿病改变了活动性结核病患者中T细胞、B细胞、树突状细胞和单核细胞的细胞亚群分布[20]。NKT是T淋巴细胞的一个独特亚群，细胞表面同时有T细胞受体和NK细胞受体。NKT细胞在功能上不同于传统的CD4+和CD8+T细胞，对脂质抗原反应较对肽抗原反应迅速，并分泌大量的Th1和Th2细胞因子[21]。有报道称，NKT细胞在结核病并发2型糖尿病患者中显著增加[20]，其原因可能是这些患者存在较高的细菌负担[22]。也有文献报道，肺结核是否并发糖尿病对淋巴细胞亚群检测结果无显著影响[23]。这说明多种因素可以影响淋巴细胞亚群检测结果，可能是患者因素，比如被研究患者的病变分期和严重程度等，也有可能是检测方法或者干扰因素等。所以，要重视结核病患者外周血淋巴细胞亚群检测的临床应用，全面综合分析检测结果，客观正确评估患者的免疫功能，有针对性地进行治疗干预。

结核病的发生与机体免疫失衡有关，而淋巴细胞亚群分析是检测免疫功能的重要指标。但是，目前临床只注重抗结核药品化学治疗，对结核病患者的免疫功能评价的关注还明显不够，免疫治疗没有引起足够重视。《共识》在“淋巴细胞亚群分析在结核病患者临床诊疗中的应用”一节中每个段落都提出一个建议，涵盖了临床上常见结核病及其并发症，如老年结核病、活动性结核病、HIV与MTB双重感染、活动性肺结核并发糖尿病、肿瘤、贫血、低蛋白血症等重症结核病患者等，体现了淋巴细胞亚群检测分析的必要性和对结核病患者免疫评估的重要性，须引起业界临床同行的高度重视，以期推动结核病的免疫治疗，造福患者。

从问题与展望中提高认识并获得经验

《共识》在最后一节“对结核病患者淋巴细胞亚群检测与分析的建议和展望”中，客观评价了淋巴细胞亚群检测目前存在的问题和改进措施。结核分枝杆菌感染的免疫机制复杂而精密，各种免疫细胞和免疫因子之间不是孤立的起作用。淋巴细胞亚群之间相互作用、相互影响，从检测报告看，同一类型的结核病患者检测结果可能不同，不同类型结核病患者检测结果可能相同。对于患者个体而言，并不是单一的淋巴细胞亚型检测水平发生变化，可能会出现多个亚型检测结果的升高和(或)降低。《共识》抛砖引玉，强调淋巴细胞亚群相对计数和绝对计数要同时检测和分析，合理选择淋巴细胞亚群检测与分析的方法，结合临床特征进行综合评估，才能指导临床正确诊断和治疗。

结核病免疫不仅需要各种免疫细胞的参与，还需要各种细胞因子的共同作用。随着人们对结核病免疫机制研究的不断深入，淋巴细胞亚群检测方法从定性到定量、检测项目从少到多，并且不断有新的淋巴细胞亚型和细胞因子被发现分析[24-25]；淋巴细胞发挥免疫调节作用主要是通过分泌细胞因子、趋化因子激活和(或)募集靶细胞来实现，比如参与抗结核分枝杆菌感染的主要细胞因子有γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素、穿孔素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子β(TGF-β)等[26]。但是，目前临床检测分析淋巴细胞亚群的数目和分类有限，还没有广泛开展细胞因子的检测，对淋巴细胞亚群功能的评价不足；为解决临床免疫治疗问题，在检测分析目前有限的淋巴细胞亚群基础上，需要对更多的淋巴细胞亚型和细胞因子的作用机制和功能进行更深入的研究。

综上，《共识》是国内第一部关于结核病患者外周血淋巴细胞亚群检测及临床应用的专家共识，全面总结了结核病患者外周血淋巴细胞亚群检测的重要临床意义和应用价值，对指导和提升医务人员对淋巴细胞亚群检测的认识提出了指导性建议。随着医学科学技术的发展，抗结核分枝杆菌感染免疫机制将会更加清晰，本《共识》会及时修订，以满足临床应用的需要，服务于结核病患者。