大肠癌基因治疗的研究进展*

王 丹，周燕红，彭 莉

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院五官医学院)

在世界范围内，大肠癌(CRC)发病率排第三位，癌症相关死亡率排第四[1]。随着环境改变，由于食用红色和加工肉类、饮酒和吸烟，以及久坐不动的生活方式，患CRC的风险正在增加。根据其发病率，病理表现为三种形式：家族性、遗传性和散发性。70%～80%的CRC是散发性的，而约20%～30%的CRC有遗传成分。事实上，尽管诊断和治疗方式有所改进，但每年仍有100多万人患CRC，每年有60多万名患者死于这种疾病。此外，手术切除CRC并不总是能防止晚期CRC的复发，25%的CRC患者在初诊时就有肝转移。因此，CRC患者在手术治疗后5年内出现局部复发和远处转移，其生存率仍然很低[2]。

基因治疗是当今生物医学、制药和生物技术领域一种新兴的研究策略，它在三十年前还是一个令人难以置信的奇迹。基因，即我们的命运决定因素，是遗传的功能单位，基因序列中的任何突变都是导致疾病的原因。基因治疗就是用一种新的健康的、有功能的基因来替代导致疾病的缺陷基因。在全球范围内，从临床前阶段到第三阶段及以后发展中的基因疗法产品有418种。进行基因治疗临床试验的国家在5大洲的36个国家开展。其中4%的试验同时在一个以上的国家进行。

癌症是最常见的基因治疗指征(64.41%)，包括不同类型的癌症：妇科、神经系统、胃肠道、泌尿生殖系统、血液学和肉瘤等。因此，利用基因疗法将遗传物质输送到癌细胞似乎是一个很好的选择[3]。本文从CRC基因治疗的研究发展、基因治疗存在问题和未来发展等进行简要综述。

1 CRC基因治疗的研究

1.1 自杀基因治疗

自杀基因治疗(suicide gene)又称基因介导的酶前体药物治疗(gene directed enzyme prodrugtherapy，GDEPT)，其基础是在肿瘤细胞中导入编码一种非哺乳动物酶的外源基因，将无毒的前药选择性地转化为有毒的代谢物。它是一种在对正常组织影响最小的基础上，通过结合使用被动、主动和转录靶向策略，在肿瘤部位诱导抗癌活性的一种方法。这种方法优于传统的癌症治疗方法，如化疗和放射治疗。自杀基因治疗的成功依赖于它的三个主要功能成分：酶、前体药和基因递送系统(载体)。在过去几年中，许多酶/前药系统已被探索，其中研究最广泛的是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)与更昔洛韦(GCV)、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)与5-氟胞嘧啶(5-FC)。

1.1.1 单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)治疗

HSV-TK与GCV是目前研究最广泛的酶/前药系统。更昔洛韦(GCV)在HSV-TK的作用下进行单磷酸化，之后在内源性激酶的帮助下产生三磷酸形式的GCV，GCV-三磷酸可以通过在DNA中引入链终止和单链断裂来导致细胞凋亡[4]。Wu等[5]分析表明，GCV-三磷酸的旁路效应可以通过连接蛋白32(Cx32)的表达而增强，连接蛋白32负责产生缝隙连接。为了提高TK/GCV系统的效率，TK/GCV系统也已与其他治疗方案联合使用，以提高其抗癌效果。Higashi等[6]构建了含人端粒酶逆转录增强子序列的载体，该序列结合了IL-18和HSV-tk基因，用于治疗小鼠结肠癌模型，实验数据显示，携带HSV-tk基因的IL-18可诱导特异性免疫应答，其治疗效果优于单基因。

1.1.2 胞嘧啶脱氨酶基因(CD/5-FC)治疗

CD/5-FC是近十年来研究最多的分子化疗体系之一。虽然5-FU已被用于癌症化疗，但在其治疗剂量下，它会引起严重的副作用，如黏膜炎、骨髓抑制、皮炎和心脏毒性。由于这些副作用，在过去的几十年里，它作为前药以5-FC的形式和与细胞脱氨酶结合的应用得到了发展。两种形式的胞嘧啶脱氨酶，细菌(BCD)和酵母(YCD)，已经在CRC症治疗的背景下进行了研究。经CD激活后，5-FU可被其他细胞酶进一步转化为有效的嘧啶类抗代谢产物。5-FU可抑制胸苷酸合成酶，从而导致细胞周期阻滞和凋亡。

CD/5-FC系统已被广泛用于治疗不同类型的癌症，包括CRC、乳腺癌、头颈部实体瘤。前药形式5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine)与细菌酶胞嘧啶脱氨酶(CD)联合应用于自杀基因治疗显示出较好的治疗效果。双自杀基因联合HSV-TK/GCV和CD/5-FC可打破对肿瘤细胞类型的依赖，表现出协同效应[7]。虽然CD/5-FC系统的使用如上所述有几个优点，但也有一些缺点需要解决，例如由于肠道中存在正常的菌群，能够将5-FC转化为5-FU，从而导致副作用。

尽管自杀基因是一种具有良好应用前景的肿瘤治疗方法，但目前的研究仍处于探索阶段。随着自杀基因研究的不断深入，如何提高肿瘤组织特异性调控因子的启动子或增强子来驱动自杀基因在特定靶细胞中的表达？特异性杀伤的产生已成为自杀基因系统靶向调控的重点和难点。

1.2 细胞因子基因治疗

细胞因子基因治疗是将细胞因子的基因转入受体细胞之后，使之转移到体内或直接将细胞因子引入肿瘤微环境，产生细胞因子，激活抗肿瘤免疫反应，在局部或远距离发挥增强或抑制抗肿瘤免疫的作用。在肿瘤的诊断和治疗中，抵制肿瘤生长的细胞因子可以通过不同的作用机理达到阻碍肿瘤进展的结果。一种类型是刺激功能性免疫细胞的表达或分化并调节免疫系统，例如白介素-2(interleukin-2，IL-2)。另一种是直接杀死肿瘤细胞，例如粒酶B(granzyme B，GrB)。源于肿瘤发生和发展的复杂性以及细胞因子性能的复杂性，某些细胞因子，例如干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)可以通过不同途径用于肿瘤治疗[8-9]。此外，IL-22在结肠癌中的作用也引起了人们的研究兴趣，研究表明IL-22促进了结肠癌的发生。例如，在细菌诱导的结肠癌小鼠模型中，IL-17和IL-22阳性的结肠固有淋巴细胞被显示在结肠中积聚，这些细胞的耗尽提供了对侵袭性结肠癌发展的保护。

1.3 抗肿瘤血管基因治疗

早在20世纪70年代，Judah Folkman就在论文中明确阐述[10]，肿瘤血管生成理论也由此形成。在过去，绝大部分抗肿瘤治疗是针对于CRC细胞的本身，但研究表明，抗肿瘤治疗对血管内皮细胞有一定的作用，两者不仅不相互抑制，还起到相互协同的作用。

肿瘤生长依赖于新生血管的形成，其生成是肿瘤转移的关键步骤，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)介导的血管生成是抗癌治疗的常用靶点，已通过不同形式的干预手段阻断肿瘤新生血管来探索。Wang等[11]通过荟萃分析评估了VEGF基因多态性在CRC患者中的预测作用，发掘VEGF-2578C→A和- 460C→T多态性是CRC患者的潜在预测因子。然而，针对血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体或蛋白与传统化疗相结合已被证明可以改善转移性结直肠癌(mCRC)的预后[12]。因此，在肿瘤基因治疗中其抗血管治疗是颇具潜力的基因治疗措施。

抗肿瘤血管基因治疗在临床中的应用还有待进一步的研究和探讨。例如，需要研究抗血管生成治疗对正常血管生长的影响；如何实现个体化的抗血管生成基因治疗，最大限度地造福患者，降低治疗成本等。

1.4 抑癌基因治疗

抑癌基因(tumor suppressor genes)，也称为肿瘤抑制基因，是一类存在于正常细胞中，阻断细胞生长并抑制癌症的基因。抑癌基因可通过点突变、DNA片段缺失、移位和突变等途径失活，失活的抑癌基因发挥其作用，使细胞不断持续生长。当基因功能水平失衡、突变等异常可引起恶性转化产生肿瘤。因而，通过恢复抑癌基因的功能可以阻碍肿瘤的发生和发展。目前与CRC密切相关的抑癌基因是p53，MCC，PTEN，p16等。

TP53是位于17号染色体短臂上的抑癌基因，编码一种重要的调节细胞分裂的蛋白质。p53通常在DNA损伤的情况下表达，导致快速分裂细胞的生长停滞和凋亡(程序性细胞死亡)。TP53基因突变发生在50%～70%的CRC中，p53的丢失或突变不仅丧失抑癌作用，同时能转变成一系列的癌基因。一项包括3500多名CRC患者的研究结果证实了p53突变的预后价值，这似乎是由原发肿瘤部位决定的。因此，改善P53肿瘤抑制因子的功能是治疗CRC的关键。腺病毒介导的p53癌基因治疗是一种很有前途的恢复野生型p53功能的抗肿瘤治疗方法，因为许多人类癌症由于p53基因的遗传改变而丧失了p53功能。体外和体内研究表明，将携带野生型p53基因的重组腺病毒暴露于CRC细胞中，具有一定的抗增殖作用，并能提高荷瘤裸鼠的存活率。目前，p53基因治疗CRC的主要方法有两种：①用野生型p53基因代替突变基因； ②用核酶技术或p53激活因子来逆转p53基因的突变。

对抑癌基因的研究有助于更好地识别CRC的发病机制，对CRC的诊断和治疗具有重要价值。然而，抑癌基因失活的具体机制以及抑癌基因之间的相互作用还有待进一步研究。

1.5 CRISPR/CAS9基因编辑

CRISPR系统在1987年首次报道，被认为是大肠杆菌核苷酸序列中一系列被无关的、非重复的短序列(间隔区)打断的短直接重复序列[13]。随着簇状规则间隔短回文重复序列-CRISPR相关9(CRISPR/CAS9)系统的发展，基因工程方面的最新进展是用于有机系统的理想选择。用CRISPR/CAS9治疗肿瘤有两种方法，即直接攻击癌细胞的关键基因和编辑免疫细胞攻击癌细胞。CRISPR/CAS9在CRC临床治疗中的应用报道较少。Burgess等[14]利用CRISPR/CAS9技术，在HCT116细胞中敲除Survivin基因，提高细胞的凋亡率。Yoshida等[15]用CRISPR/CAS9基因敲除Snora21基因，证明抑制Snora21的表达将导致CRC细胞的增殖、侵袭、转移，甚至凋亡和死亡。虽然CRISPR/CAS9工具近年来发展迅速，但在其效率、免疫原性，特别是非靶点效应方面仍存在一些问题[16]。

2 存在的问题

虽然大多数与CRC相关的主要癌症基因都已经有了很好的特征，但在CRC基因治疗的临床实践中仍有许多困难需要克服，如：①目前CRC基因治疗的安全性尚未得到很好的处理，许多基因缺陷疾病的初期诊断仍然困难，靶向基因引入靶细胞技术也缺乏；②临床前研究工具的开发也是一个关键的研究领域，例如在个体患者水平建立肿瘤模型[17]，改进提高转移性CRC患者存活率的临床方法[18-21]；③基因治疗应用于临床的成本控制；④基因治疗在多系统基因疾病治疗中的作用尚不清楚。

3 未来展望

目前正在进行的基因治疗临床试验成功的共同特点是：①疾病是由缺乏功能蛋白引起的，突变蛋白的存在不会干扰治疗；②由于表达水平不理想和特定疾病，不需要调节表达；③基因治疗的表型纠正可以通过直接将基因传递到有丝分裂后组织或通过干细胞的基因修饰间接实现。因此，为了使基因治疗在治疗中得到更广泛的应用，该领域需要超越基因添加策略。其中一个途径是将基因组编辑技术结合起来，要么纠正内源性致病基因，要么将治疗基因整合到一个确定的基因位点上。最初的工作主要集中在建立原理证明和开发用于这些基因编辑工具的试剂和动物模型上。

尽管CRC基因治疗的临床前研究结果很有希望，但临床上显著的抗肿瘤作用仍有待证实。为了达到临床效果，应在近期内研究不同基因治疗策略的结合或基因治疗与常规化疗或放疗的结合。此外，将CRC的基因治疗方法范围扩大，并且开发可检测转移的基因表达及评估药代动力学的无创成像系统将成为未来发展的主题。