类器官模型在前列腺癌异质性研究中的应用

周丽桂，张永斌，师长宏

(1.广州中医药大学实验动物中心，广州 510000； 2.空军军医大学实验动物中心，西安 710032)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是全球第二大最常见的男性癌症，在2018年全球癌症统计[1]中报告了127万多新病例和将近36万死亡病例。高度异质性是其主要特征，目前PCa临床上的常规治疗方案仍然是雄激素剥夺治疗法(androgen deprivation therapy，ADT)。然而，大部分原发性PCa患者经过一段时期的ADT治疗后，会逐渐对ADT产生耐药性进而从激素依赖性前列腺癌(hormone naïve prostate cancer，HNPC)转化为去势抵抗性前列腺癌(castration- resistant prostate cancer，CRPC)[2]。由于CRPC具有侵袭性和高度异质性，致使不同PCa患者对同一治疗药物常表现出不同的反应，导致药物临床试验的成功率大大下降。因此，尽管已经开发出许多PCa细胞系和动物模型，但均未能充分体现PCa的异质转化特征，导致对其病因和发病机制的了解仍然相当有限，迫切需要异质性模型来概括PCa独特的临床表型和基因型。

人源性类器官(patient-derived organoids，PDOs)是指来源于多能干细胞或分离的器官祖细胞在体外通过三维(3D)培养技术分化出具有多种细胞类型，并形成与体内器官相似的器官样结构[3]。2014年，Gao等[4]成功利用活检组织标本和循环肿瘤细胞培养出体现PCa特异性改变的类器官模型，推动了类器官参与PCa相关医学研究的进展。与人源化异种移植(patient-derived xenograft，PDX)、2D细胞系培养等模型相比，PDOs这种体外培养的三维微器官模型不但简化了动物实验的繁杂性，还在一定程度上还原了细胞或组织在体内的转化过程。同时它在培养过程中能较好的维持遗传稳定性，反映亲代肿瘤的特征。类器官可再现肿瘤的异质性并与患者原发瘤对药物的反应具有较高相关性的特点，可用于模拟并间接观察处于不同临床阶段且具有不同特异性突变的PCa患者对各种抗肿瘤药物的反应，并评价其敏感性。同时，PDOs模型便于体外进行大规模高通量药物筛选，在PCa异质性研究中显示出独特的优势。

1 前列腺癌类器官的培养

1.1 前列腺癌类器官培养条件探索

传统的PDX模型是将从病人身上得到的新鲜肿瘤组织注射到免疫缺陷小鼠体内进行培养，而PDOs模型则是将分离出的多能干细胞或器官祖细胞置于基质胶中进行三维培养。与2D细胞系培养相比，PDOs的培养方式不仅可以为肿瘤细胞或组织提供类似在肿瘤患者体内生长、发育的环境，还可通过调整培养基配方中的生长因子、激素等筛选不同特异性改变的肿瘤细胞并培育为类器官。Sato等[5]首个开发出类器官通用培养基“ENR”：即Advanced DMEM/F12培养基中加入表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、Noggin及Wnt激动剂R-spondin1。在此基础上，Karthaus等[6]额外添加了Alk3/4/5抑制剂A83-01、二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)、成纤维细胞生长因子10(fibroblast growth factor-10，FGF10)、FGF2、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、烟酰胺及p38抑制剂SB202190用于人前列腺类器官的培养。其中R-spondin1、Noggin分别通过促进Wnt信号传导[7]和调节BMP信号通路[8]进而促进类器官细胞增生，且去除R-spondin1或Noggin会导致雄激素受体(androgen receptor, AR)表达的消失[6]。EGF是前列腺类器官增殖和分化所必需的生长因子，FGF2、FGF10和PGE2有助于促进前列腺细胞的增殖[6,9]。A83-01可通过抑制TGF-β信号通路促进细胞持续增殖，与SB202190协同作用有助于延长类器官的培养时间，烟酰胺的加入也有助于提高类器官的培养效率，有趣的是，A83-01、SB202190、烟酰胺均具有相同的抑制细胞分化作用[5-6]，DHT为类器官生长的非必需因子，但其有明显提高类器官形成效率的作用且能保持前列腺类器官AR信号的完整性[6]。这些生长因子、激素等构成了支持前列腺(癌)细胞在3D培养系统中生存和长期培养的基本条件。由于不同亚型的PCa突变背景不同，所需要的添加物组合也相应有所不同。有研究发现B27、Rho激酶抑制剂Y-27632和N-乙酰半胱氨酸可为人前列腺(癌)类器官的培养提供一定的支持[10]。目前前列腺(癌)类器官的培养条件还在不断探索和改进中，如Richards等[11]最新发现在前列腺癌上皮细胞中加入原发性前列腺基质细胞共培养不仅可通过维持PCa的特异性分子标记物AMCAR(α-methylacyl- CoA racemase，α-甲基酰基-辅酶A消旋酶)的表达，提高肿瘤类器官的生存率和形成效率，还能引导上皮类器官分支的形成并表达调控分支的因子，如骨形成蛋白、FGF等，促进类器官表达出与原组织相似的表型，提高了类器官对组织特征的概括能力并保持了PCa患者间的异质性。这些研究表明前列腺(癌)类器官是在培养基中添加前列腺特异性生长因子培养出来的，可通过调整培养基修饰进一步优化类器官培养条件，构建不同亚型的PCa类器官。

1.2 前列腺癌类器官模型的建立

前列腺癌类器官来源广泛，目前已成功利用正常组织、肿瘤活检样本、循环肿瘤细胞、PCa细胞系、前列腺癌PDXs模型等分别建立相应的类器官模型。Karthaus等[6]利用小鼠前列腺上皮细胞和人正常前列腺标本培育出由完全分化的CK5+基底细胞和CK8+管腔细胞组成的前列腺类器官，发现该类器官保留了完整的AR信号、前列腺特异性转录因子Nkx3.1、基底细胞标记物p63和CK5、管腔细胞标记物CK8的表达，同时将构建的Pten敲除、TMPRSS2-ERG融合基因等小鼠的原组织进行类器官培养后，其表型与原组织的表型一致。同时,Gao等[4]将来自转移性PCa患者的活检组织标本、循环肿瘤细胞成功培育出7个概括了PCa亚型的分子多样性的类器官，充分体现了PCa的临床异质性，包括TMPRSS2-ERG融合、ETS易位、SPOP突变、SPINK1过表达、FOXA1和PIK3R1突变、CHD1缺失、Pten缺失和AR表达等，较好保留了原发瘤的基因组特征。这表明PCa类器官能很好地重现PCa原发瘤组织的异质性，为PCa研究提供了一种体现肿瘤患者表观遗传性和异质性的体外模型。人前列腺癌细胞系LNCaP、C4-2B细胞及单腔上皮祖细胞也能通过类器官培养技术产生PCa类器官[12-13]，前者为雄激素依赖模型，后者为非依赖模型，分别代表了不同的临床特征。此外，最近报道了一种结合类器官和PDXs优点的新型体外建模系统，这种PDX-类器官模型比单独的PDXs模型更节省时间和成本，为类器官的建立提供了充足的组织来源。LuCaP系列是来自PCa转移灶的外科手术标本，包括了21种前列腺癌的PDX模型。Beshiri等[14]将来自LuCaP系列具有转移性CRPC(metastatic CRPC，mCRPC)特征的PDX模型组织样本进行类器官培养，发现其相应的类器官模型保留了mCRPC的基因组异质性和对AR信号的依赖性，成功建立了一个具有代表性的、临床前PDX衍生类器官平台，与激素依赖型PCa和非转移性CRPC形成鲜明的对比，为mCRPC的发病机制、药物筛选和个性化治疗方案的研究提供了一个良好的遗传学平台。

2 前列腺癌类器官模型的应用

2.1 前列腺癌发病机制研究

驱动前列腺癌发病和一系列临床异质性转化的机制并不是很清楚，其相应的类器官与原发组织相似度较高，并保持基因组表达的稳定性和原代肿瘤组织的异质性，为PCa发病机制及不同阶段的临床特征研究提供了良好模型。有研究已通过动物模型和PDX模型实验[15-16]证实了新生儿期暴露于双酚A(bisphenol A，BPA)会增加成年后前列腺癌的易感性。为了检测人胎儿前列腺是否同样受到类似的影响，Calderon-Gierszal等[17]将人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)定向分化为前列腺类器官，并在整个分化培养过程中暴露于低剂量BPA。期间对该类器官进行前列腺上皮基因和多种前列腺标志物检测以验证前列腺的性质，发现其表达CK8/18、AR、p63、TMPRSS2蛋白、PSA、NKX3.1、层粘连蛋白和波形蛋白，证实了hESC可分化为具有与人类前列腺相似的结构和功能特性的前列腺类器官，而BPA显著提高该类器官波形蛋白、NANOG、CD49f、TROP2的表达和减少其分支的形成，证明低水平的BPA可以靶向hESC，干扰人前列腺形态，特别是前列腺干细胞稳态，这表明发育中的人前列腺可能易受子宫内BPA的干扰，由此提出暴露于低剂量BPA可能会增加人胎儿前列腺在以后生活中癌变的几率。另外McCray等[18]利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术对人原发性前列腺类器官模型进行分析，发现与单层细胞培养相比，类器官培养含有更多不同中间类型的前列腺上皮细胞，并鉴定出10个细胞群，有效展现前列腺癌的异质性，其中包括一种罕见的以角蛋白13(Keratin 13，KRT13)、淋巴细胞抗原6D(Lymphocyte Antigen 6D，LY6D)、LYPD3(Ly6/PLAUR domain containing3)和前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)高表达为特征的前列腺干细胞群。这表明了scRNA-seq分析和PCa类器官培养技术的结合可更深入地了解存在于PCa模型系统中不同的细胞群种类，创建PCa细胞群图集。此外，PCa类器官体外培养的易操作性也为利用CRISPR/Cas9基因编辑系统等对特定基因进行编辑提供便利性，通过基因编辑可观察不同基因突变对PCa发生、发展和异质性转化的影响。

2.2 药物筛选和个体化治疗

由于PCa类器官在保持遗传稳定性的同时还保持着异质性，已成为肿瘤药物毒性筛选、药效评价研究和个体化治疗研究的理想模型。Gao等[4]为探索CRPC衍生的类器官是否适合药物测试，用培育出的PCa类器官对恩杂鲁胺、依维莫和BKM-120进行药物敏感性测试，发现AR扩增的MSK-PCa2细胞系对恩杂鲁胺敏感而对其他药物耐药，同时存在PTEN缺失和PIK3R1突变的MSK-PCa2对依维莫和BKM-120均敏感，这与体内实验结果一致，证明其对药物敏感性的效果与临床试验结果相似。另外Beshiri等[14]发现，BRCA2突变的PCa类器官对奥拉帕尼敏感，该结果与在BRCA2突变的CRPC患者临床治疗观察到的反应一致。这些实验结果提示运用类器官进行药物筛选和个体化治疗具有一定的可操作性。同时PDXs-类器官平台结合了PDXs模型优点(展现疾病遗传和表型多样性)和类器官(易于体外大规模培养)的特点，可用于扩大体外CRPC模型的数量和多样性，同时，还为运用高通量筛选技术在体外大规模筛选用于mCRPC的治疗药物和相应的个体化治疗方案提供可能。值得注意的是，2018年发表的一项关于类器官模拟转移性胃肠道癌症的治疗反应的研究中[19]，运用高通量药物筛选技术测试了类器官对靶向药物和化疗药物的敏感性，结果表明类器官对抗肿瘤药物具有高度敏感性和特异性，这表明PDOs模型可以高效预测个别患者的药物反应，针对不同的病人实现个体化治疗。因此将不同PCa患者的新鲜肿瘤样品制备成PCa类器官培养物并进行个体化建模，通过靶向或高通量的单药和组合药物筛选，可进一步指导精准个体化治疗和促进新的抗肿瘤药物的研发。

2.3 耐药机制

大部分PCa患者会对药物的治疗出现不同程度的耐药进而发展为CRPC，导致治疗难度增加，理想的PDOs模型可以动态展示CRPC的转化。基因组学和转录组学分析显示，mCRPC可能存在三种耐药机制[20]：一是基因突变(如AR、ETS、TP53和PTEN基因等突变)导致AR信号通路的激活[21]；二是旁路信号GR(glucocorticoid receptor，糖皮质激素受体)通路的激活促进GR的表达[22]；三是在治疗过程中，肿瘤细胞从依赖于药物靶标转换为不依赖于药物靶标，从而获得耐药性[23-24]。上述耐药机制需要在模拟PCa表型和基因型的模型系统中进行验证，相应的异质性PDOs模型需要展示各自的耐药机制。目前雄激素敏感的PCa和CRPC类器官模型均已建立，也有通过诱导产生CRPC转化的模型，同时利用CRISPR/Cas9或慢病毒转染技术对PCa类器官的特定基因进行基因编辑操作，可使PCa类器官成为快速检测不同特异性突变对抗肿瘤药物影响的平台，为研究PCa耐药的分子机制提供支持。Pappas等[20]利用前列腺癌类器官模型发现p53基因的缺失不会引起对雄激素分子的抵抗，Pten基因的缺失则增加了对抗雄激素药物的抗性，而p53和Pten的双重缺失导致了对第二代抗雄激素的完全抵抗。另外，还发现了前列腺类器官培养基组成会影响药物反应，如EGF是小鼠和人类前列腺类器官培养基的组成部分，但它可以大大降低对抗雄激素的敏感性，影响PCa耐药机制的研究。因此，类器官培养有助于在体外通过构建异质性PCa模型，并借助基因编辑技术研究特定基因对PCa耐药的影响，从而促进一线治疗药物的改进，或是寻找出新的治疗靶点提高新药研发效率。

3 展望

PCa类器官作为一种新型的体外临床前疾病模型，具有广阔的应用前景。从疾病模型的角度看，PCa类器官模型不仅便于体外操作，还具有遗传稳定性和异质性，可结合PDX动物模型对PCa的发病机理、药物筛选等研究进行多模型验证[25-27]。从疾病研究角度来看，PCa类器官可以在体外直观观察肿瘤细胞或组织的生长、发育变化以及不同突变背景对疾病发生、发展的影响，为研究PCa的异质性转化机制提供有效的指导，比如，深入了解雄激素抵抗产生的分子机制，发现潜在的治疗靶点。从药物筛选和个体化治疗的角度看，利用不同来源的PCa样本建立不同的原发性或转移性PCa类器官，并通过结合高通量筛选技术可批量获得抗PCa药物和高效预测PCa病人对不同药物的反应，有助于加速推动开发针对PCa异质性特征的治疗方案。从研究耐药机制的角度看，利用CRISPR/Cas9和shRNA技术对PCa类器官进行表达干扰操作，可以分析耐药性基因的功能，有针对性改进一线治疗药物或研发新的个体化药物。

虽然PCa类器官建模已取得较多进展，上皮性和神经内分泌性PCa类器官模型已被建立，但目前为止，神经内分泌细胞的类器官培养方法尚未成熟，还有许多问题需要进一步探讨。为了更好的体现PCa的临床异质性，未来还需要不断改进培养条件以更好地支持不同类型前列腺癌细胞的生长，进一步研究肿瘤微环境和成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞等的作用，使PCa类器官组织结构更好地代表体内PCa的组成。

同时，PCa类器官依旧存在一些缺点。(1)总体培养成功率较低，限制了临床多样性前列腺癌模型的广泛开发。如Gao等[3]利用转移性前列腺癌活检标本培养连续传代的类器官，总体成功率仅有15%～20%。(2)缺乏从雄激素依赖性到CRPC的模型，mCRPC的模型就更少。目前PCa患者材料来源有限，特别是很难获得mCRPC患者的临床样本，因此建立PCa类器官生物资源库的困难较多，造成目前可用的CRPC类器官数量很少，不能完全代表临床疾病的异质性，这使得类器官在PCa研究中的应用受到限制。(3)PCa类器官建模还受到一些培养条件的限制，如培养出的PCa类器官只含有上皮细胞和(或)基质细胞，还缺乏某些肿瘤组分，如免疫细胞、血管成分等等。目前具有免疫兼容性微环境的PCa类器官模型尚未开发，无法进行免疫治疗方面的研究。另外PCa类器官的某些培养基成分会影响药理反应，如EGF可能会影响PCa类器官对药物的敏感性。总之，还需要对PCa类器官的培养条件不断优化，构建更加适应PCa不同突变背景的肿瘤微环境，进一步提高PCa类器官培养的成功率，以期获得更多不同表型和基因型的PCa类器官，特别是构建从HNPC到CRPC直至mCRPC发生的模型，充分展示PCa临床异质性，构建相应的类器官库。

综上所述，类器官在PCa异质性研究方面虽然已取得一定的进展，但仍存在许多挑战，还需要不断进行探索。相信随着相关技术的发展，PCa类器官的建模体系会不断完善，逐步形成PCa生物资源库，最大限度展示其临床特征，成为PCa首选的临床前疾病模型。