软组织损伤动物模型及其评价方法研究进展

江炜,梁嘉欣,陈艳芬

(广东药科大学中药学院,广东 广州 510006)

软组织损伤(soft tissue injury)是临床一种多发病,是指因急性外伤或慢性劳损或其他原因导致的皮肤、肌肉肌腱、关节囊及神经等组织的病理损伤,但不包括骨骼疾病如骨折、脱位等,临床主要表现为局部软组织的青紫、瘀斑、肿胀、疼痛、功能障碍等[1]。损伤后机体局部主要以炎性反应为主,组织损伤后即进入修复阶段,修复过程是炎症因子、生长因子协调细胞过程的复杂信号的整合。虽然软组织损伤在临床上治疗方法较多,但由于缺乏有效的评价方法,研究水平目前仍偏低。为了系统地总结软组织损伤的相关研究,为临床治疗和基础研究提供借鉴,本文对急、慢性软组织损伤动物模型及其评价指标进行简要综述。

1 急性软组织损伤模型

1.1 重物击打致软组织损伤模型

重物击打致软组织损伤模型是通过重物在一定高度自由落下打击软组织部位导致的损伤,是目前软组织损伤模型中最为常用的,实验动物可选择小鼠、大鼠或兔子。刘俊宁等[2]等选用小鼠,将其固定后用50 g砝码作为打击锤,打击高度5 cm,自由落体打击标记处,连续5次,造成小鼠局部急性软组织损伤。有学者[3-4]取雄性SD大鼠,用200 g圆台型锤,从光滑硬塑管长75 cm内径1.5 cm,自由落下打击小腿肌肉,无骨折现象,造成急性软组织损伤。申旭霁等[5]取日本大耳白兔,使500 g重的砝码通过比砝码直径略大的塑料管腔自30 cm 高处垂直自由落体击打同一部位连续5次,造成兔软组织挫伤,并证实无骨折现象。重物击打致急性软组织损伤造模方法简单,成模率高,且与临床中的常见软组织损伤较接近；但是在打击高度、打击次数及打击重量,都未解决“定量”的关键性问题,缺乏对损伤程度标准化和量化的评判标准,有可能造成实验结果的不一致[6]。

1.2 机械冲击急性软组织损伤模型

机械冲击急性软组织损伤模型,通过在软组织部位给予一定的冲击力,对其造成损伤。Robert等[7]选用雄性Wistar大鼠,麻醉后,然后采用计算机辅助的高压冲击装置,气动驱动加速11 mm螺栓,冲击速度7 m/s的条件下,螺栓接触大腿软组织,向下冲击深度为11 mm,停留时间为0.1 s,造成封闭性软组织损伤。余飞等[8],取SD大鼠,右后肢褪毛,伸膝、趾背屈约90°位固定,并用纱布垫将右后肢稍垫起(防止骨折),将直径为1.1 cm的铁质螺母固定器置于小腿腓肠肌中段上方压紧,500 g砝码从30 cm高处自由下落,动能1.47 J,作用在固定器上方,同一部位连续打击10次,造成急性软组织损伤。

1.3 锐性切割急性软组织损伤模型

锐性切割急性软组织损伤模型是通过将皮肤及肌肉切割,造成的开放型损伤。Sefei等[9]将雄性Wistar大鼠麻醉后,左侧股骨颈处切开,解剖皮肤层、皮下层、肌肉层。微型镊子处理30 s,缝合,24 h后成模。赵道洲等[10]取日本大耳白兔麻醉后,剪开皮肤,钝性剥离以暴露腓肠肌,在距肌腱止点6.5 cm 处用手术刀做不完全锐性切割,做一长0.8 cm,宽0.4 cm 的切口,压迫止血,24 h后成模,会出现切割局部红肿、瘀血及跛行等现象。由于伤口直接暴露于空气中易发生感染,Shang等[11]通过注射抗生素防治感染,但也有学者为了研究感染性软组织损伤,向切割部位滴加金黄色葡萄球菌菌液导致软组织损伤感染[12]。

1.4 肌肉拉伸急性软组织损伤模型

张胜年等[13]将麻醉的大鼠仰卧位左右足固定于固定板上,踝关节游离状态,然后在大鼠大腿近、远端分别插入一根银质针电极,连接电刺激仪,以50 V的电压刺激小腿三头肌肌群使其强直收缩,同时以 0.55 m/s 的速率反向牵拉大鼠足底固定板,迫使大鼠小腿三头肌发生离心收缩,从而造成大鼠骨骼肌急性牵拉伤。郭小琳等[14]将麻醉的大鼠俯卧固定于大鼠固定板上,固定大鼠右侧膝关节和小腿,用生理实验仪 YSD-4GA(频率为128 Hz,强度为 50 V),电刺激大鼠右侧腓肠肌两端,使其强制性收缩,踝关节发生跖屈趋势。与此同时,砝码从固定高度自由下落(200 g, 100 cm),通过系在大鼠脚上的绳子以一个恒定的基本冲量,使踝关节迅速背屈。腓肠肌强直性收缩拉伤,造成该肌肉急性拉伤,既而形成软组织损伤动物模型。

1.5 其他急性软组织损伤模型

除上述软组织损伤造模方法还有一些较少运用的方法,如注射法 、压迫法、爆炸性软组织伤模型及软组织血管放射损伤模型等。注射法是通过取自身的血液注入软组织部位引起的炎症[15]、肿胀及瘀血等症状,造成软组织损伤。压迫法是通过长时间或者多次给予压迫,使动物局部组织损伤,如张楠等[16],通过在长时间在大鼠两侧后肢的股薄肌处上下侧各放置一块相同规格的永久性磁铁进行施压,造成软组织损伤。爆炸性软组织伤模型,如王翔等[17-18]将点爆源置于垂直于动物面部咬肌前缘中点上方处引爆,造成面部软组织损伤。临床上放射治疗肿瘤的同时也会引起组织血管的损伤,王代友等[19]将雄性 Wistar 大鼠选取右后肢作为照射部位, 以60Coγ射线为放射源, 采用远距离外照射的方式,每次每只大鼠的吸收剂量为2 Gy,90 s内完成,每周照射3 次,共5周形成软组织血管放射损伤模型。

2 慢性软组织损伤动物模型

2.1 重物击打致慢性软组织损伤模型

重物击打致慢性软组织损伤模型,打击方法同急性软组织损伤相同,但打击后长时间不给予治疗,造成的慢性软组织损伤。高渐联等[20]将大鼠后肢置于伸膝、踝背屈 90°位,将200 g 重的砝码垂直高处(50 cm)自由落体打击大鼠外侧肌肉丰厚处,连续击打3 次,打击面积约 1 cm2,不做处理正常饲养 2 周。杨威等[21]取新西兰兔,采用质量约0.8 kg、边缘钝的金属物体,在30 cm高度自由落体,击打兔右大腿部,重复3次,正常饲养6 d,造成慢性软组织损伤动物模型。

2.2 机械冲击慢性软组织损伤模型

机械冲击慢性软组织损伤动物模型,通过控制每次打击动能,给予相同的机械冲击,模型重复率高稳定性好,撞击后长时间不给予处理,造成慢性软组织损伤。董静等[22]将大鼠后肢固定,用质量为335 g打击物从80 cm高空垂直下落,动能为2.63 J,打击面积为1 cm2,受伤局部区域皮肤完整,已经解剖及组织学验证成功率为100%。之后不作处理正常饲养15 d,形成慢性软组织损伤动物模型。

2.3 锐性切割慢性软组织损伤模型

通过切割软组织与长期运动训练结合,导致动物软组织长期损伤且持续运动加重损伤,从而形成慢性软组织损伤。Shang等[11]将大鼠麻醉后从髌骨内侧切口,切开内侧副韧带,开放膝关节腔,用眼刀前后切开交叉韧带,术中关节软骨表面无损伤,止血后逐层缝合；第7天每组用动物跑步机训练模拟运动损伤,连续训练20 d,然后大鼠正常饲养2周,形成慢性软组织损伤。该模型损伤外观明显,易于观察整个损伤及恢复过程,易于药物的药效评价。

2.4 下坡跑慢性软组织损伤模型

通过训练大鼠长期下坡跑,导致肌腱损伤,该动物模型与生活中长期走下坡路导致肌腱损伤相近,但造模时间长、成模率低,导致运用较少。秦乐等[23]将下坡跑与打击法结合,改良了下坡跑慢性软组织损伤模型,先通过筛选出配合下坡跑训练的大鼠,后重物打击大鼠大腿右侧股内侧肌,造成局部钝挫伤。每周下坡训练2次,共8周,然后正常饲养4周,12周后形成慢性软组织损伤模型。

2.5 肌肉拉伸慢性软组织损伤模型

在电刺激辅助,使动物长时间做跑跳运动,导致肌肉拉伤。牛文玉等[24]采用高压低流电刺激仪刺激动物,使其产生跑跳运动,具体方案如下：每只动物每隔12 s刺激1次,每次刺激时间持续 0.1～0.2 s,每天训练60 min,分 3 次进行,两次训练间隔20 min。每天跑跳约300 次,每周连续训练5 d,连续训练5周,造成慢性软组织损伤。

3 软组织损伤指标观察

3.1 形态学指标

形态学是软组织损伤最基本的观察指标,也是最直接反应软组织损伤恢复的情况的指标。软组织损伤会出现红肿、瘀青、跛行等症状,可采用肉眼观察、HE染色、超声检查等方法来观察其形态变化。其中肉眼观察指标评分是目前文献使用较多的标准(见表1[25-26])。章建华等[27]在三黄软膏治疗急性软组织损伤的实验研究中,通过观察大鼠软组织损伤部位红肿、跛行及疼痛感,治疗组大鼠外观形态恢复较模型组快。也有学者[28]通过对软组织损伤部位做HE染色、超声图谱,观察到损伤恢复情况包括组织结构、炎症浸润、血管等。

表1 损伤指数评分表Table 1 Injury index score table

3.2 血液学指标

血液学指标主要包括血液流变学、血小板活性、血清胆红素、血清微量元素等指标检测,主要研究局部微循环血流速度、血流量变化和血液黏稠度等。魏优秀等[29]在治伤软膏外敷治疗大鼠急性软组织损伤的实验研究中,证实治疗组的血液流变学检测全血黏度、红细胞压积、红细胞还原黏度与对照组比较明显降低；说明治伤软膏外用治疗急性软组织损伤模型大鼠,能明显降低血液黏度、改善其血液流变性、促进损伤组织的修复。王佳等[30]在郑氏筋导散对大鼠急性软组织损伤的影响及血液流变学机制分析中,得到郑氏筋导散与七厘散都能改善大鼠急性软组织损伤后血液的黏滞状态,改善全身血液循环,具有较好的活血化瘀功能。软组织损伤后血液黏度增大,血流速度降低[31],药物治疗软组织损伤过程中有无改变血液状态,是观察药物对软组织损伤是否有效的一个重要指标。

3.3 炎症因子

软组织损伤及恢复整个过程有较多炎症因子参与,其中起主要作用的是肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)等。TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质,能激活中性粒细胞和淋巴细胞,使血管内皮细胞通透性增加,调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。IL-6能诱导B细胞分化和产生抗体,并诱导T细胞活化增殖、分化,参与机体的免疫应答,是炎性反应的促发剂。IL-8能刺激中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋化,促进中性粒细胞脱颗粒,释放弹性蛋白酶,损伤内皮细胞,使微循环血流淤滞,组织坏死,造成器官功能损伤。Truflandier等[32]在机械通气调节大鼠脊髓损伤后炎症因子的表达研究中,发现软组织损伤诱导局部IL-6表达,机械通气对炎症因子产生影响,使大鼠脊髓中TNF-α独立升高,IL-1β水平降低。杨威等[33-35]在701跌打镇痛膏对新西兰兔急、慢性软组织损伤的作用及机制研究中,结果表明降低组织中IL-1、IL-6等炎症因子含量利于软组织损伤恢复。

3.4 生长因子

生长因子能促进细胞分化分裂,加快组织愈合,在软组织损伤恢复过程中起到不可代替的作用,特别是表皮生长因子(EGF)家族、转化生长因子β(TGF-β)家族、成纤维细胞生长因子(FGF)家族、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)等[36]。杨姗姗等[37]在研究ZD制剂对软组织损伤的药效时,得到ZD制剂在马急性软组织损伤模型中能够调控VEGF、bFGF的表达,促进成纤维细胞、毛细血管,肌细胞再生来进行组织修复。Scott等[38-39]收集了22例接受髌腱开放性缝合的患者和10例接受胫骨髓内钉治疗的患者的髌腱组织,发现VEGF在髌腱中表达的患者比未检测到VEGF的患者症状持续时间短,VEGF表达增加有利于软组织损伤的恢复。

3.5 其他指标

目前在软组织损伤研究中,除以上指标外还有一些常用指标,如一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)等,大部分与氧化应激反应相关。覃博等[40-42]在接活跌打膏对急性软组织损伤大鼠的影响及机制研究中,接活跌打膏对软组织损伤模型大鼠损伤组织 SOD、MDA水平的影响和正常对照组比较,模型组大鼠损伤组织SOD的活性显著下降,损伤部位MDA水平显著增高。与模型组比较,接活跌打膏28 g/kg药材剂量组可显著提高损伤组织SOD 的活性,降低损伤部位MDA水平。SOD和MDA参与软组织损伤恢复过程,在软组织损伤的病理状态下,自由基生成增多,且自由基清除酶活性降低,动态平衡被破坏,启动自由基连锁反应,引发膜的脂质过氧化反应,造成组织损伤的进一步恶化。MDA是氧自由基攻击脂质导致过氧化的代谢终产物,反应体内自由基的生成水平及对组织的损伤程度,SOD可以催化氧自由基发生歧化反应,降低自由基含量。

4 小结与展望

动物实验是现代医学研究的一种主要手段[43],所以选择合适的动物模型与评价指标尤为重要,最好与实际临床症状及病理学改变相关指标相似、重复性好、操作简单。综上所述,软组织损伤目前最常用的是重物击打致损模型,与临床中软组织被重物打击后,导致的损伤相近,其造模成功率高、方法简单、造模时间短等,但打击的高度、打击物的重量、打击次数存在较大差异,导致模型维持时间症状不稳定；肌肉拉伸软组织损伤模型,与临床中运动性肌肉拉伤相近,造模成功率高、时间短,但造模方法相对其他较复杂,需要电刺激大腿肌肉,使其强制性收缩,同时用一定力拉伸腿部,导致肌肉拉伤；锐性切割软组织损伤模型,与临床中软组织被锐器切割导致的损伤相近,造模成功率高,重复性高。大多慢性软组织损伤模型建模时间长、成模率低,导致研究慢性软组织损伤研究的学者较少,但随着社会的发展人们对慢性疾病越来越关注,学者应该重视慢性软组织损伤的研究。此外,目前软组织损伤研究,较少从分子及基因水平研究损伤的机制,药物如何影响炎症因子和生长因子的信息传递,而参与调节局部炎症反应、局部组织的修复等过程,这些有可能成为软组织损伤研究的重点。