骨髓潜伏态巨细胞病毒痕量反复激活诱导免疫衰老的单细胞RNA 测序技术研究进展

刘普恒,韩 辉,王宇虹

(哈尔滨医科大学附属第一医院 老年医学科,哈尔滨 100081)

免疫衰老是老年人高发病率和高死亡率的核心机制之一。 广泛潜伏在老年人群骨髓干细胞的人巨细胞病毒CMV,通过一个分化依赖的反复痕量激活机制,长期诱导并累积T 细胞的免疫衰老[1]。由于CMV 的痕量激活起始于骨髓干细胞,且病毒潜伏的骨髓干细胞比例很低,潜伏态CMV 的激活表达量也很低[2-3],而且这些骨髓干细胞表面不产生任何CMV 相关抗原标记物,这个痕量激活通过偶联CD34+全能干细胞的分化[4-5],通过细胞内的传递几近 “无痕” 的到达树突状细胞(dendric cell,DC)。 树突细胞中痕量激活的CMV,通过一个细胞-细胞间接触的方式进行抗原提呈,“沉默” 地诱导T 细胞发生CMV 特异性的免疫应答[6]。 虽然这种应答不能有效地清除CMV 潜伏库,但是骨髓内的CMV 在普通人群中(无免疫缺陷) 启动大量激活而产生急性CMV 病。 通过潜伏态病毒和宿主的痕量反复互作,纯真(naïve)T 细胞的多样性逐渐耗竭,“无效” 记忆效应T 细胞克隆扩增大量累积,伴随每次痕量＄应答产生的低水平炎性因子,构成了一个漫长的免疫衰老的核心进程[6-8]。 由于该过程隐蔽,痕量,反复,病毒-宿主互作,CMV 诱导免疫衰老的分子调控机制,一直是全球公认的难题。 伴随单细胞RNA 测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) 技术的发展, 免疫衰老的CMV 诱导调控机制正逐渐被揭示。

1 骨髓潜伏态巨细胞病毒反复痕量的激活诱导外周血T 细胞免疫衰老的概述

全世界绝大部分人会在不知不觉中携带感染人巨细胞病毒,老年人群的携带率接近100%。 人巨细胞病毒(HCMV) 是一个拥有巨大DNA 基因组的疱疹病毒,它初次感染后,即在骨髓干细胞(称为允许细胞/ Permissive cell) 中建立终生潜伏感染。潜伏态CMV 能通过一个痕量反复激活的机制,诱导宿主发生反复痕量的免疫应答,累积形成免疫衰老,其主要累及T 细胞的适应性免疫衰老。 免疫衰老是老年人高发病率和高死亡率的核心机制之一。传统定义的病毒潜伏期,是在不产生子代病毒的情况下维持病毒基因组,但具有为随后的几轮复制而重新激活的能力。 在潜伏期中,病毒仅转录有限数量的病毒RNA,蛋白质和microRNA。 人类巨细胞病毒(HCMV)潜伏在骨髓干细胞中,具有干细胞分化依赖的基因累积表达特点,它的潜伏期激活机制,更为复杂[9]。 在普通人群中,CMV 的痕量反复激活能够诱导宿主产生免疫应答,但是宿主无法识别清除病毒潜伏库,这种痕量激活也不能导致宿主发生急性疾病。 这种 “病毒―宿主” 之间存在的百万年共进化, 产生了复杂的共生( Co-pathogen)机制。

CMV 在骨髓的痕量机会, 伴随全能干细胞(CD34+CD14-)分化为单核系前驱/ 祖细胞(CD34+CD14+),并且继续分化为单核/ 树突细胞( CD34-CD14+)[9-10]的过程[5,11]。 大型DNA 病毒CMV 就是通过这种近乎完美的免疫逃避机制[12],将病毒从潜伏库干细胞,传递至到抗原提呈DC 细胞/ 单核细胞中。 而且,骨髓干细胞中的CMV 潜伏细胞比例很低,应用PCR 结合原位杂交技术,预测其潜伏细胞阳性率约为1 ∶10000 ～25000,每个潜伏感染细胞的CMV 拷贝数为2 ～13 个基因组[13]。 即使应用基于单细胞的高敏感数字PCR,能提高人群的的阳性率,使接近一半的HCMV 潜伏携带的骨髓干细胞中检测到病毒基因组,但是细胞基因组的检测阳性率,也少于10 / 10000 个细胞[14]。 此外,通过检测外周血中极少量干细胞来源的CD14+CMV 潜伏细胞中的CMV 基因载量,并未发现CMV 潜伏感染率的年龄相关[14],这提示潜伏态CMV 的痕量激活量,是一个与宿主免疫功能息息相关的互作机制。 目前的研究结果显示,潜伏态CMV 在分化偶联的痕量激活过程中,未检测到足够量的病毒转录本和蛋白表达(无法通过普通PCR 或者Western blot 检测到),也未检测到细胞表面表达的病毒特征性蛋白(无法通过流式细胞术检测),这为潜伏态CMV 痕量反复激活诱导免疫衰老的机制,提出了严峻的挑战。

2 骨髓潜伏态巨细胞病毒痕量反复激活体外实验的单细胞研究进展

CMV 的潜伏库建立在骨髓全能造血干细胞中,而骨髓造血干细胞是一个具有动态分化程序的异质细胞群,而且对体外刺激很敏感。 这些CD34+造血干细胞分化依赖的细胞群中,仅很小一部分携带CMV 转录本, 且始终伴随干细胞的分化, 潜伏态HCMV 逐步发生了痕量复制和转录的动态变化。 由于骨髓潜伏态CMV 的病毒载量和表达水平均极低,加上携带CMV 基因组的骨髓细胞群具有动态变化特点,宿主的免疫功能又显著影响 “病毒-宿主” 的互作模式,因此,应用单细胞RNA 测序进行CMV 基因表达的探索,具有突破的意义。 一个单细胞测序分析数据显示,25 名CMV 血清阳性的造血干细胞转录本库(1.5×1010序列),未能成功比对获取CMV序列[15]。 进一步比对基因组织表达( Genotype-Tissue Expression / GTEx)数据库,一个收集人类健康尸检组织RNA 测序信息的数据库,对31 个组织549 个样本(> 4.33 ×1012核苷酸)进行CMV 序列比对,仅从40 个样本中比对得到了潜伏期激活基因( Immediate Early / IE ) 基 因 的 序 列[15]。 体 外 对3.655 个原代感染CMV 的CD14+细胞进行经时(time-dependent)单细胞测序,分别构建宿主和病毒转录本库,发现CMV 的痕量激活仅发生在一个特定表达细胞集落刺激因子的细胞亚群,这些细胞富含线粒体激活基因,细胞增殖基因,RNA 加工基因和蛋白质合成基因,且始终保持较高转录水平;同时,干扰素相关基因的表达下调,提示CMV 发生集落刺激和分化诱导的激活[16]。 此外,这些单细胞数据显示CMV 从早期痕量表达状态逐渐演进为病毒裂解和大量表达,是否存在一个演进门槛值需要深入研究[15]。 需要指出的是,体外原代感染的CD14+细胞,主要显示骨髓干细胞分化偶联的从痕量潜伏期过渡至大量激活期的转录本的后期过程,无法模拟慢性潜伏态CMV 分化偶联的痕量激活转录特点[15]。 Galinato 等[16]对原代感染的7.000 个骨髓干细胞进行单细胞测序,发现大多数干细胞中检测到了CMV 的DNA 序列,表明病毒的入侵潜伏不受限制,其激活可能受到宿主的限制。 Shnayder 等[17]分别检测了造血干细胞(HSPC)和多系祖细胞中的CMV 转录本,证实CMV 转录仅在造血干细胞的单核细胞祖细胞中检测得到,且与宿主抗病毒免疫应答降低有关。 这些单细胞RNA 测序数据,明确了潜伏态CMV 干细胞分化诱导的痕量激活机制。

3 巨细胞病毒激活诱导外周血免疫衰老的单细胞水平研究进展

T 细胞受体(TCR)提供的抗原特异性细胞毒性T 细胞,是宿主抗病毒的核心机制。 这些TCR 多样性通过一个建立在基因重排基础上的单个细胞抗原特异性受体储备库实现。 因此,TCR 多样性储备的逐渐降低,是T 细胞免疫衰老的核心机制。 巨大DNA 病毒CMV 的痕量反复激活,能诱导产生外周血最庞大的TCR 记忆效应T 细胞克隆扩增。Atsushi 等利用荧光标记的抗原肽四聚体技术,结合高识别度单细胞微矩阵,筛选人CMV 的抗原特异性TCRβ 储备库,获取了外周血比例约0.05% ～8.5%的CMV-pp65 克隆扩增[18]。 检测感染鼠巨细胞病毒(MCMV)的小鼠脾以及肠道淋巴组织中病毒特异性T 细胞,得到了MCMV 特异性记忆效应CD8+T 细胞的单细胞转录谱[19],这些肠道淋巴组织内的循环CD8+T 记忆细胞(TPM)克隆扩增相关基因(KLRC1,KLRK1(NKG2D),KLRG1,CX3CR1) 以及常驻记忆T 细胞( resident memory T-cells ( TRM), S1PR1,S1PR5,ITGAE,KLRG1) 相关基因存在交互表达。与循环记忆T 细胞高表达CX3CR1 而不表达KLRG1 相比,CMV 抗原激活的T 细胞克隆显示出相对静止( activated yet resting) 的免疫衰老相关特点,即高表达KLRG1 和CX3CR1。 通过外周血TCR的单细胞数据,进一步证实了CMV 反复痕量激活诱导T 细胞免疫衰老的特点[19]。 研究者比较了潜伏感染MCMV 的老年小鼠和无MCMV 潜伏的老年鼠针对新抗原( OVA) 的特异性CD8+T 细胞受体β(TCRβ)转录本,克隆扩增多样性最广泛的宿主,是老年MCMV 潜伏感染小鼠,这些小鼠识别新抗原肽的能力更高;老年MCMV 潜伏感染的小鼠发生了针对OVA 的强烈适应性T 细胞免疫应答,而无MCMV潜伏感染的小鼠,其TCR 多样性明显降低。 这些单细胞数据提示,潜伏态CMV 痕量反复激活可能对老年人群的适应性免疫发挥 “疫苗样” 积极影响,证实了与宿主长期共进化的病毒与宿主衰老之间的复杂关系[20]。 另一个单细胞RNA 测序研究则显示,针对新抗原入侵的高亲和力TCR 在TCR 组谱(TCR repertoire)中优先扩增,这种进化依赖的亲和力适应性,能被潜伏态CMV 的反复痕量激活削减[21]。 因此,为了揭示宿主共进化CMV 的终身潜伏激活,宿主TCR 多样性和TCR 亲和力,以及新抗原入侵的T细胞免疫应答之间的关系,需要更多基于单细胞RNA 测序的研究数据。 外周血人类自然杀伤(NK)细胞也在免疫衰老中也发挥重要作用,由于NK 的功能细胞表型非常复杂,通过对NK 细胞进行单细胞测序,能获取伴有或不伴有CMV 潜伏感染的NK细胞表型差异表达谱。 CMV 的潜伏感染能显著改变NK 细胞的功能集簇,提高适应性NK 亚群的比例,诱导CMV 适应性的NK 应答[22]。

4 针对骨髓CMV 潜伏感染调控机制的单细胞研究展望

通过单细胞的研究,研究者发现骨髓CMV 潜伏期的转录,其实并非休眠和沉默[1,23],越来越多的CMV 潜伏期转录信息通过单细胞技术的改良而获得。 需要指出的是,普通单细胞测序平台仅提供基因表达的 “快照”,无法动态传达转录的过程,而且每个单个细胞的RNA 谱只能分析一次,因此,大部分体外原代感染的CD14+细胞内未测到CMV 的基因表达(< 0.1% HCMV 读数)。 这个结果或提示CMV 基因组受到高度抑制,或者提示该细胞并未被感染,因为骨髓干细胞中的CMV 细胞阳性率很低。同时, CD34+干细胞的病毒转录水平, 显著低于CD14+细胞,提示骨髓干细胞能抑制CMV 的激活。为了鉴别低水平CMV 转录本是 “ 真正的” 的零转录,还是初始潜伏在干细胞病毒拷贝比例低,需要动态比较CD34+干细胞与CD14+单核细胞的单细胞转录谱。 这种同时描绘病毒和宿主异质性的单细胞RNA 测序平台,能够揭示宿主细胞环境与病毒基因表达之间的功能联系,已经用于多个 “ 宿主-病毒” 互作研究,对宿主免疫应答的复杂性和病毒的细胞允许性,提出了很多新颖的见解[16,24-30]。

需要指出的是,针对无偏见转录组的单细胞测序敏感度,需要细胞内转录≥50000 个核苷酸序列[31],很多病毒低水平激活达不到这个水平。 骨髓CMV 的痕量激活转录组,甚至低于1.0000 个核苷酸,这导致单细胞测序的数据稀疏( sparsity of the data), 即零读数的占比( proportion of zero read counts)过高[32-33]。 “稀疏” 的病毒转录本很可能因为低丰度表达而 “ 被弃( dropouts)”[32]。 通过基于单细胞的液滴样数字PCR(Droplet digital PCR,DDPCR),理论能够测到低于100 个核苷酸的转录本,从而检测到极低水平的核苷酸拷贝数[34]。 然而,单细胞测序,无论单细胞RNA 测序,还是单细胞DDPCR,均存在固有的随机性,需要加强样品的质控和标准化。 基于唯一分子标识符(UMI) 技术,理论上可以消除测序深度偏差[35],但是UMI 仍然无法解决捕获效率或细胞mRNA 含量差异的问题。

伴随单细胞测序技术的迭代,用光反应核苷类似物(4sU) 进行核苷代谢标记(U-to-C conversion)的单细胞测序(scSLAM-seq),通过区分生化核苷代谢程度(转录顺序的早晚),对每个细胞中数千个基因的转录活性(核苷生化代谢程度) 和表达差异进行同步可视化。 用scSLAM-seq 动态检测小鼠成纤维细胞中巨细胞病毒原代感染的细胞转录本,能建立宿主转录动力学( TBP-TATA-box 相互作用和DNA 甲基化)相关的基因表达差异,通过RNA 转录时间(新旧程度)推断细胞周期状态,结合病毒感染剂量,获取由CMV 感染诱导所致的单个细胞之间的转录组异质性,得到病毒相关的宿主转录数据,是目前针对CMV 转录的最全面数据[36]。 总之,单细胞测序研究平台的发展和迭代,为揭示潜伏态CMV痕量反复激活诱导免疫衰老的复杂调控机制,展示了光明的前景。