昆虫唾液介导的植物与植食性昆虫防御与反防御研究进展

侯子强，林金盛，马 林，曲绍轩*，李辉平，蒋 宁，侯立娟，骆 昕

(1.江苏省农业科学院 蔬菜研究所，南京 210014；

2.江苏大学 生命科学学院，江苏 镇江 212013)

在自然界中，植物和昆虫已经共存了4亿多年，在长期的适应进化中，它们之间逐渐形成了一种复杂的相互作用关系，如共生、寄生、竞争和捕食.一方面植物和昆虫互惠互利，促进了彼此物种的繁衍.另一方面二者存在竞争和捕食而相互制约，也促进了彼此的协同进化.事实上，昆虫与植物之间的捕食关系是十分普遍的，因此植物进化出了多种防御机制来抵御昆虫的取食，包括预先存在的组成型防御，并辅以诱导型防御等策略来应对昆虫为害[1].诱导型防御依赖于植物对攻击者的感知，通过信号转导级联反应，介导植物防御化合物的生成，这些化合物是有毒的或对植食性昆虫有排斥作用.诱导防御可分为直接防御和间接防御.直接防御包括能够增强植物抵抗昆虫攻击的内源性能力，而间接防御则会通过一种独特的挥发性化合物激发食肉动物的外源干预.研究证明，在昆虫取食植物的过程中，昆虫唾液中的某些成分在相互作用中诱导植物防御，同时唾液中的其他成分能有效的抑制这些植物防御，其中能够被植物识别从而激活植物防御的称为激发子(elicitors)，而能够减弱或抑制植物防御的称为效应子(effectors).

近年来，针对植食性昆虫诱导防御及信号转导研究取得了许多进展.诱导直接和间接防御似乎共享了许多信号转导途径，而诱导防御的产生却离不开昆虫唾液的作用.因此，在关注植物诱导防御的同时，还应深入了解昆虫唾液在植物防御中的作用.昆虫唾液作为分泌到取食部位的主要物质是昆虫对植物施加影响以及植物感知虫害的重要途径，对其成分的探究将有助于揭示相关作用元件.本文将重点放在昆虫唾液在植物与植食性昆虫相互作用的分子对话上，揭示昆虫唾液激发子和效应子、植物模式识别受体以及作为传递纽带的信号转导系统间的互作机制，以期对昆虫与植物之间复杂的相互作用网络有更全面深入的了解，有助于深入了解植物与植食性昆虫间的协同进化.

1 激发子介导的植物对植食性昆虫的防御策略

植物通过启动两种防御措施应对植食性昆虫的侵害，组成型防御和诱导型防御.组成型防御是植物本身固有的特性，如植物的刺、有毒物质等，直接阻碍昆虫的取食或生存.诱导型防御是指植物被植食性昆虫取食后所产生的一系列防御物质或生理特征的变化导致昆虫难以进一步取食.研究表明，植物已进化出精密的检测攻击者的方式：植物诱导抗性的开-关效应[2].当昆虫取食发生时，植物会通过其细胞表面的模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)对植食性昆虫唾液中的特异性激发子进行特异性识别，从而激活植物防御反应(HAMP-triggered immunity,HTI)的产生.

1.1 植食性昆虫唾液中的激发子

到目前为止，已经从植食性昆虫的口腔分泌物中鉴定出多种能够引起植物抗虫反应的植食性昆虫激发子.其中一些激发子在昆虫进攻时产生，然后作为昆虫口腔分泌物注射到植物组织中，因此人们多以昆虫口腔分泌物而非唾液腺作为研究对象.当植物识别出植食性昆虫的激发子时，它们会产生并释放各种挥发性化合物，吸引捕食性动物、寄生蜂和其他天敌.已知植食性昆虫激发子有脂肪酸-氨基共轭物、含硫脂肪酸、细胞壁碎片、脂肪酰胺、肽、脂类和蛋白酶类[3].下面介绍研究最为广泛的几类昆虫激发子.

1.1.1 脂肪酸-氨基共轭物 在植食性昆虫唾液中，目前已经鉴定出来多种能够引起植物诱导防御的激发子，其中发现最早的是脂肪酸-氨基共轭物(fatty acid-amino conjugate,FAC).脂肪酸-氨基共轭物是由16或18碳不饱和脂肪酸和L-谷氨酰胺(或L-谷氨酸)组成.不同昆虫种类的脂肪酸-氨基共轭物存在不同的形式[4]，其中挥发物诱导素(N-(17-hydroxylinolenoyl)-L-glutamine)是最早被鉴定的一种脂肪酸-氨基共轭物.这种诱导素首次在甜菜夜蛾幼虫口腔分泌物中被发现，其诱导玉米幼苗产生挥发性气体吸引天敌寄生蜂，而这些挥发物不是机械损伤所诱导的[5].近年来，研究人员发现拟南芥植物可特异性识别植食性昆虫唾液中的FACs，并迅速向植物系统发出长距离信号，激活丝裂原活化蛋白激酶信号途径(mitogen-activated protein kinase,MAPK或MPK)和茉莉酸信号[6]；Block等研究发现植食性昆虫衍生的FACs能以类似于植物损伤引发防御反应的方式，引发植物体内活性氧的爆发，进而引起植物防御应答[7].

1.1.2 蛋白类激发子 昆虫口腔分泌物中含有多种酶，包括蛋白酶、糖苷酶和氧化酶.葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOX)、β-葡萄糖苷酶和果胶酶等能够引起植物的诱导防御.Tian等[8]研究发现，GOX可引起番茄体内茉莉酸水平的显著上升，同时触发番茄产生毛状体，影响食草动物对植物的攻击.然而根据宿主植物的不同，GOX既可以作为激发子，也可以作为效应子.为确定GOX是否在茄科其他物种中也存在着相同的作用结果，Lin等[9]利用6种不同的茄科植物，测试GOX对植物防御的诱导作用，结果表明，GOX只在番茄和辣椒这两种有限的植物中起到的诱导作用，表明植物之间免疫防御系统存在很大的差异.β-葡萄糖苷酶是最早报道的蛋白类激发子.在机械损伤的卷心菜上施加β-葡萄糖苷酶，会引起植物释放挥发性混合物，从而吸引寄生黄蜂，起到间接防御的作用[10].此外，小麦蚜虫唾液中的果胶酶被证明可诱导植株产生挥发性物质，吸引天敌.这些表明β-葡萄糖苷酶、果胶酶在诱导植物间接防御过程中起着重要作用[11].

1.1.3 其他激发子 已经发现了其他激发子，例如，夜蛾唾液中一种由叶绿体ATP合酶γ-亚单位的蛋白水解片段形成的二硫键合肽，可快速诱导豆类防御相关植物激素的增加，而拟南芥、茄子和烟草对这类激发子无反应[12].蚱蜢口腔分泌物中发现了一种二硫脂肪酸[13].与FACs一样，这类脂肪酸激发子诱导玉米幼苗中的挥发性萜类化合物的释放，但这些挥发物的确切作用方式尚不清楚.此外，植食性昆虫取食时会破坏植物组织的完整性，而植物可以通过识别“受损的自身”如细胞壁碎片来调节对植食性昆虫的防御[14].总之，这些结果表明，植物对植食性昆虫识别的生物机制是多样的.尽管目前关于昆虫激发子和目标植物响应的信息已经存在，但在昆虫与植物之间还存在大量尚未发现的诱导子，它们也会介导植物的防御反应，而植物识别系统的多样性和特定植食性昆虫的进化将会让植物-植食性昆虫之间的关系变得更加复杂.

1.2 植物模式识别受体(PRRs)

当植物感受外界环境变化时,细胞质膜上的受体蛋白最先进行感知,其中较为典型的是细胞膜上的类受体蛋白激酶.然而对于这些膜受体是否像识别病原激发子一样，直接感知虫害信号并触发早期防御反应，至今尚不明确.

1.2.1 富含亮氨酸的重复受体激酶 富含亮氨酸的重复受体激酶(leucine-rich repeat sequence receptor-like kinase,LRR-RLK)是类受体蛋白激酶中最大的一个亚家族，在拟南芥、水稻、番茄等植物中广泛分布.虽目前已有很多LRR-RLKs被发现，但仅有部分LRR-RLK被鉴定出了功能，在这些已被报道的基因中发现，LRR-RLK在各种信号转导、植物受体等方面发挥了重要作用.例如，水稻中的一种LRR-RLK被证明是感知和防御高粱条螟的重要物质.当水稻受到昆虫攻击时，LRR-RLK转录受到显著上调，同时作用于MAPK信号途径，正向调控相关转录因子表达，激活植物防御反应[15].此外，有研究报道LRR-RLK与植物抗性有关.研究人员通过数量性状图谱将抗蚜基因定位到含有LRR-RLK亚家族基因簇上，预示着LRR-RLK在植物抗性以及植物模式受体方面的效应[16].这些研究表明，植物抗性的产生可能与LRR-PLK作为植物受体对昆虫取食做出防御响应的结果.

1.2.2 植物凝集素 凝集素类受体蛋白激酶(lectin receptor-like kinases,LecRLKs)是RLKs家族中另一个亚族.近年来,越来越多的研究表明,LecRLKs蛋白的功能极其广泛,可参与调控各种生物和非生物胁迫和植物发育[17].LecRLKs蛋白对于植物的抗虫性也极其重要.RNA干涉野生烟草中的LecRK1基因后，虫害诱导产生的相关防御素显著降低，且对于烟草天蛾的抗性减弱[18].水稻Bph3是一种对褐飞虱具广谱抗性的基因，该基因包含编码凝集素的三个基因的簇，即OsLecRK1，OsLecRK2和OsLecRK3，在OsLecRK基因敲除植株和OsLecRK断点重组植株中发现，水稻对于褐飞虱抗性的降低与这些OsLecRK转录水平降低有关，并表明该基因群的成员共同作用赋予了Bph3对褐飞虱的抗性[19].随着植物凝集素在防御虫害侵袭、清除入侵病原微生物等许多方面功能被发现，将凝集素基因克隆应用于植物抗病虫基因工程上，已呈现出巨大的农业应用前景.

1.3 昆虫诱导早期信号事件

植食性昆虫的攻击会引起植物细胞中一系列的生化反应，这些反应传递报警信号，最终会引起植物防御代谢物的积累.早期信号事件包括去极化、钙通量的改变、活性氧的产生以及丝裂原激活蛋白激酶.这些信号反应已在不同的植物中被观察到，甚至这些信号反应渐渐地构成了一种转化昆虫攻击的一般机制.

1.3.1 膜电位、钙通量和钙传感器 当昆虫唾液中的激发子被植物识别后，会引起植物体内Ca2+流变化，大量的Ca2+涌入导致摄食处K+内流的通道打开，引起细胞膜电位发生去极化[20].如桃蚜取食拟南芥叶片后,在取食部位引起快速而高浓度的Ca2+内流，并在表皮和叶肉细胞中传播[21].随后，细胞内Ca2+的变化通过各种Ca2+传感蛋白进一步转化为下游信号，激活植物下游反应.因此，在植物的诱导防御中，Ca2+以细胞第二信使的身份，在植物免疫应答的信号转导途径中发挥着重要作用.

1.3.2 活性氧 活性氧(reactive oxygen species,ROS)已被证明在植物对生物和非生物胁迫中发挥着多种功能，根据其在植物细胞中的浓度起着双重作用，在低水平时，它们可以作为细胞内信号转导剂，传递细胞信号.在高水平下，所有形式的ROS都具有毒性，起抗菌作用[22].试验通过对大豆外源施加植物多肽类激发子，发现植物中ROS大量积累并提高了大豆对线虫取食的抗性[23].ROS作为植物抗性的信号分子激活剂，主要来自于生物和非生物胁迫下的植物质膜NADPH氧化酶的催化.研究发现烟草天蛾唾液能够显著诱导烟草NADPH氧化酶转录水平的上调，沉默氧化酶基因后，唾液诱导的ROS量下降，烟草更易受到昆虫侵害，结果表明活性氧的产生也是是植物诱导抗性的重要机制之一[24].

1.3.3 MAPK信号 MAPK信号途径是真核生物调控各种细胞内信号传递与细胞反应的重要枢纽.水稻中OsMPK3和OsMPK6基因可通过对JA生物合成的正向调节，从而提高水稻的抗虫能力[25].同样，许多研究也已经证明昆虫取食以及损伤都能激活MAPK途径，并且MAPK也作为早期信号产生下游响应，激活植物响应[26].

分子研究已为钙信号、ROS和MAPK信号参与植物对植食性昆虫的响应提供了明确理论证据来支撑植物早期防御信号传导级联模型.然而主要问题仍然存在，潜在的植物受体是否可以跳过信号转导级联直接调控植物防御，以及取食引起的机械损伤所带来的信号传递与昆虫唾液引起的信号传递是否同时存在交集，对此植物是否存在独立的信号调节网络来区分不同状态下的情况.

1.3.4 激素信号响应 植物激素作为信号分子在调控植物生长发育中发挥着重要的作用.当植物受到昆虫攻击时诱导产生早期信号反应，激素信号网络连接早期信号进而诱导植物防御基因的表达.目前，发现了多种植物激素与植物诱导防御相关，如茉莉酸、水杨酸、乙烯、肽激素等.

茉莉酸(Jasmonic acid,JA)信号通路作为植物防御反应的核心通路，已有很多关于JA信号通路的研究报道.Qi等[27]将黏虫的唾液施加于玉米创面，发现可诱导玉米JA及JA衍生物水平的升高.JA存在多种不同的活性形式，包括JA-异亮氨酸偶联物(Jasmonoyl-isoleucine,JA-Ile)和茉莉酸甲酯，其中茉莉酸甲酯在茉莉酸信号途径以及胁迫防御反应中具有广泛的应用[28]，JA-Ile则在植物抗虫防御中起到重要的作用.正常情况下，JA和JA-Ile在植物细胞中维持一个较低的水平，当植物细胞遭受到昆虫攻击时，JA-Ile与促进茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白(Jasmonate ZIM-domain,JAZ)降解的泛素连接酶结合释放下游转录因子激活防御基因，JAZ蛋白是转录因子阻遏物，它控制JA信号的输出[29].此外，基于JA诱导植物抗性的理念，研究人员对香豌豆叶片进行外源JA处理后发现，香豌豆对烟粉虱产生了抗虫性[30].这种通过外源JA处理诱导抗性的方法，已在农业中得到很好的应用.

水杨酸(Salicylic acid,SA)是一种酚类化合物，在调节植物对植食性昆虫的防御方面也起到了重要的作用.枸杞瘿螨取食诱导了宁夏枸杞中SA含量的显著提升，从而激活植物NPR1基因转录，NPR1与转录因子TGA互作，诱导PR1基因表达，提高植物抗性[31].SA甲基化产生的水杨酸甲酯是一种可移动的韧皮部信号，可以从受感染的叶片传递到全身组织，再转化回SA后激活植物防御机制[32].此外，植物激素之间也存在着某些相互作用关系，如水杨酸与茉莉酸之间的拮抗作用.入侵型烟粉虱的唾液蛋白Bt56蛋白是通过与烟草中的一个转录因子(NTH202)在韧皮部互作，诱导SA积累导致JA信号减弱，从而使其更有利于在植物上的存活[33].研究表明，SA可以作为植物JA防御信号的负调控因子.

植物肽类激素，同植物经典激素一样，对植物体的生长发育等生理活动具有重要的调控作用.西红柿系统素是第一个被发现的植物多肽激素，该激素的发现更新了植物激素概念.系统素的感知主要依赖于一对LRR-RK同源基因，即SYR1和SYR2.其中，SYR1作为主要的系统素受体，该蛋白与系统素具有高度亲和并且特异的结合能力，其对于植物抵抗昆虫取食具有非常重要的作用[34].自从该激素的发现以来，人们又发现了许多的植物多肽类激素，在植物生活史的多个方面发挥作用，包括生长、发育、授精以及植物与共生生物间的互作.例如，植物磺肽素(Phytosulfokine,PSK)是较早被发现和研究的一种含两个酪氨酸磺化修饰的五肽激素，在植物的生长发育、抗逆和先天免疫等方面有广泛调控作用[35].

2 效应子介导的植食性昆虫反防御策略

最初的试验表明，昆虫体内的效应子可以对植物防御起到干扰作用，包括将昆虫口腔分泌物作用于植物表面，并确定其对植物防御的抑制影响，及随后对产生昆虫的影响等.因此，昆虫会通过分泌多种类型的效应子，从而在多个层面上干扰植物防御，进而更好地适应环境.

2.1 解毒酶

植食性昆虫的取食会诱导植物产生有害的次生代谢产物.同时，昆虫也会分泌相应的物质来分解植物产生的次生代谢物，实现对寄主的适应.昆虫体内的解毒酶包括氧化还原酶(酚酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶)与水解酶两大类.其中细胞色素P450s以及过氧化物酶在抑制植物防御中的作用已得到充分证实[36].植食性昆虫通常将葡萄糖氧化酶(GOX)分泌到植物上，以抵消植物防御带来的损伤.对于GOX的解毒作用，可能是其产生的信号分子(过氧化氢)，通过膜扩散进入细胞，而不通过受体蛋白传导[37].昆虫还会通过分泌纤维素酶水解植物细胞壁，克服植物防御.褐飞虱唾液中的β-1,4-葡聚糖酶NlEG1可通过降解植物细胞壁中的纤维素来帮助褐飞虱以水稻为食，同时NlEG1还可以规避JA和JA-Ile介导的水稻防御反应[38].在昆虫取食过程中，植物细胞不可避免地会受到伤害，一些DNA片段会从细胞核中释放出来并引发植物防御反应.研究发现飞虱唾液中的脱氧核糖核酸酶II(Deoxyribonuclease II,DNase II)在抵抗植物防御中起到关键作用，推测DNase II可能是通过降解细胞外的DNA来抑制植物防御，并提出了一种基于DNase II的入侵模型，可帮助飞虱克服植物防御[39].

2.2 钙结合蛋白

到目前为止，已经报道了几种昆虫唾液中的Ca2+结合蛋白，如黑尾叶蝉唾液蛋白NcSP75[40]和蚜虫唾液蛋白Armet[41].这些蛋白可以与细胞内的Ca2+结合，通过防止筛管堵塞来降低宿主防御.Ye等[42]研究发现，褐飞虱唾液腺中的NISEF1蛋白具EF结构，可在褐飞虱饲喂时分泌到水稻植株中，通过与细胞内Ca2+结合来调节水稻的钙信号通路，从而影响防御相关信号的产生.此外，飞虱唾液中还有许多其他的Ca2+结合蛋白，包括钙调素、钙网蛋白、钙调蛋白、膜联蛋白和EF手域蛋白[3].钙结合蛋白与Ca2+之间的这种互作关系，破坏了植物的阻塞反应，为以韧皮部取食的昆虫提供韧皮部汁液的流动，从而抵消植物防御带来的损害.

2.3 其他候选因子

研究人员通过对昆虫唾液及唾液腺进行转录组、蛋白组并辅以功能基因组学等分析方法，发现了大量潜在的昆虫效应蛋白，并且已经成功的对部分昆虫效应子进行了功能叠加(效应子的过表达)或功能丧失(效应子基因沉默)的功能研究.如利用RNA干扰技术敲除稻叶蝉唾液蛋白NcSP75可使其若虫寿命缩短一半并引起严重的发育迟缓[40].在植物中过表达蚜虫唾液蛋白Me10、Me23、MpC002和Mp55可增强蚜虫繁殖力，而Mp10、Mp42、Mp56、Mp57和Mp58的表达会降低蚜虫的繁殖力[43].同时已经鉴定出多种对昆虫繁殖和取食有促进作用的其他效应子，棉铃虫口腔分泌物中的HARP1效应子，在拟南芥中通过降低植物JA响应，帮助昆虫取食[29]；烟粉虱唾液中的效应蛋白Bsp9，一种最有效的免疫抑制剂因子，可直接与免疫调节剂WRKY33相互作用，通过感染WRKY33和MAPK级联来抑制植物免疫信号[44].通过对昆虫效应子的深入了解，将会为相关害虫的防治以及农药开发等工作提供新的治理策略.

此外，了解效应器与植物受体之间的信号传导以及下游信号传递方式，对于构建植物-昆虫互作模型以及开发新的害虫治理策略都有着不可或缺的作用.

3 结语和展望

在自然界中，植食性昆虫与植物之间无时无刻不在进行着植物防御与昆虫反防御，而植物又通过自身的特异抗性基因识别出植食性昆虫的效应子，从而激活效应子诱导免疫反应的产生，这过程是一个相漫长而复杂的过程[45].

昆虫唾液在这种复杂的相互作用关系中起着关键的作用.在昆虫取食的过程中，昆虫需要分泌效应蛋白到寄主植物中，以调控植物防御反应并使其成功取食.而植物对昆虫取食的防御反应通常与昆虫唾液中的某些蛋白有关，并且植物对虫害诱导的信号转导级联以及防御应答反应已经在几个系统中得到表征[41].这一过程中涉及到膜电位变化、ROS爆发和MAPK信号级联，以及水杨酸、茉莉酸、肽类等激素防御反应的激活.但是，目前关于昆虫激发子相关植物受体的研究，以及效应子在寄主植物中的作用靶点等问题仍所知甚少.

随着多组学和基因功能分析(例如RNA干扰，植物中蛋白质的过表达和转基因技术)等检测手段应用与昆虫口腔分泌物的活性因子的鉴定，促进了新的功能因子的发现、激发和效应受体的定位、信号转导中第二信使的发现及作用方式，让人们对植食性昆虫-植物之间的相互协同、相互抵御、相互进步的关系了解的更为深刻，为研究新型害虫防控策略提供新思路.