种植体表面改性对骨结合作用的研究进展

纳飞，李自良，谢志刚

(昆明医科大学附属口腔医院种植科，昆明 650500)

金属钛及其合金常被运用于口腔种植领域[1]，种植牙无需制备邻牙，固位力和稳定性能极佳，且形态逼真，美观，效果好，随着人们生活水平和生活质量要求的提高，种植体植入逐渐成为牙列缺损修复的首选方法。种植体植入口腔牙槽骨中，骨结合的形成是种植体周围软硬组织形成并稳定的前提条件，也是种植体长期稳定的重要保障。为加快种植体表面骨结合的发生，提高种植体的种植成功率，生物化学改性是常用的方法之一[2]。研究发现，很多生物活性分子可运用到骨再生领域，加快新骨生成[3]，其作用机制可能是这些生物活性分子与体内的细胞因子、生长因子结合，并通过与细胞外的整合素、受体相作用，直接或间接影响细胞的增殖、迁移、黏附以及分化能力[4]。

种植体表面的生物化学改性是将具有生物活性的小分子蛋白采用特定的方法固定于种植材料表面[5]，通过诱导特殊细胞分化(成骨细胞、破骨细胞、间叶充质干细胞)和软硬组织改造，加快骨结合的发生，如若将具有抗菌性能的小分子蛋白涂布于种植体表面，还可增强种植体表面的抗感染能力，提高种植体的长期稳定性。细胞外基质蛋白中的小分子活性蛋白精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)肽、胶原蛋白Ⅰ、纤连蛋白、层粘连蛋白等具有促进成骨细胞增殖、迁移以及分化的作用[6-7]。RGD肽可通过分子桥与另一种小分子蛋白结合，层粘连蛋白可加快成骨细胞聚集于种植体表面。此外，可由成骨细胞分泌的小分子蛋白——骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)也有促进成骨结合发生的功效[8]。近年来学者们发现，RGD肽、胶原蛋白Ⅰ、BMP-2、纤连蛋白等小分子蛋白还可附着于钛片或种植体表面，直接或间接促进成骨细胞增殖分化，加快骨形成[9]。现就RGD肽、胶原蛋白Ⅰ、BMP-2、纤连蛋白等小分子蛋白修饰于种植体表面后对骨结合作用的影响予以综述。

1 RGD

RGD肽广泛存在于细胞外基质蛋白中，细胞表面的整合素蛋白能识别并结合这个序列，从而介导细胞与细胞基质间的黏附，启动细胞信号转导，激活与生长、增殖相关的基因的转录，促进细胞代谢和蛋白质合成，增强细胞附着、增殖、分化和矿物质沉积。

Secchi等[10]的研究发现，RGD肽可通过抑制促凋亡蛋白酶的产生，促进成骨细胞黏附于种植体表面。Pagel等[11]研究发现，一种贻贝来源蛋白(mussel-derived peptide，MP)既能与RGD和肝素结合蛋白(heparin binding protein，HBP)结合形成MP-RGD-HBP肽，又能作为一种固定分子将MP-RGD-HBP固定于钛片上。将人类骨肉瘤细胞(SaOS-2)分别置于附着MP-RGD-HBP、MP-RGD、MP-HBP的钛片上培养，结果显示，MP-RGD-HBP改善骨肉瘤样细胞黏附、生存和增殖的能力明显优于MP-RGD和MP-HBP。

RGD肽还可缩短成骨细胞附着于钛片的时间[12]。Dayan等[13]的研究显示，RGD肽可作为一种“分子桥”，将二氢硫辛酰胺脱氢酶蛋白吸附于钛片，加快成骨的细胞黏附、增殖，促进其矿化。有研究发现，将RGD肽与具有抗菌性能的肽共同吸附于种植体表面，不仅可以加快骨结合的发生，还可增加种植体表面的抗菌性能[14]。有研究将罗红霉素和RGD肽共同修饰于钛片表面发现，其有效增强了成骨细胞在钛片上的黏附能力，减少细菌在钛片上的集聚黏附[6]。还有研究发现，线状RGD肽与环状RGD肽加快骨结合发生的能力不同，环状RGD肽明显强于线状[15]。采用氧化锆等瓷材料制作的种植体是近年研究的热点，研究发现，RGD肽可附着于氧化锆制作的种植体表面，并加快骨结合的发生[16]。

以上研究均表明，RGD肽不仅自身能加强成骨细胞黏附于钛片或钛基种植体表面，还可作为“连接蛋白”通过共价结合与另一种促进成骨细胞增殖的蛋白结合，进一步加快骨结合的发生。此外，RGD肽与另一种抗菌肽结合黏附于种植体表面，加快骨结合发生的同时也增强了种植体表面的抗菌能力，提高种植体的长期稳定性。提示RGD肽运用于口腔种植体生物化学改性方面有巨大潜力。

2 胶原蛋白Ⅰ

胶原蛋白Ⅰ是骨细胞基质的主要成分，大约占骨细胞基质蛋白的80%，可通过整合素β1通路提高细胞的黏附能力[17]。

Stadlinger等[18]的研究发现，胶原蛋白Ⅰ修饰的种植体在骨种植体界面上的成骨效果明显优于对照组，表明胶原蛋白在体内有促进骨整合的作用。研究表明，在骨质不好的区域，胶原蛋白Ⅰ修饰的种植体可明显加快骨结合的发生[19-20]。有学者采用化学方法将胶原蛋白Ⅰ吸附于钛片表面发现，上皮细胞的增殖率和迁移率明显高于对照组，提示胶原蛋白Ⅰ可运用于口腔种植美学领域[21]。Morra等[22]的研究显示，胶原蛋白对早期骨整合有效。Costa等[23]研究了胶原蛋白对表面用纳米技术处理的钛片上培养的大鼠成骨细胞的影响，结果显示，胶原蛋白的涂布增加了细胞的增殖和碱性磷酸酶的活性，同时提高了骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨钙蛋白等的表达，提示钛片表面纳米技术处理联合胶原蛋白附着可促进骨生成。

对于疏松的骨质而言，Li等[24]将胶原蛋白Ⅰ和透明质酸复合修饰的种植体植入卵巢切除的骨质疏松小鼠中，结果发现，种植体表现出较好的生物相容性、成骨性能和抗破骨细胞性能。Zhang等[25]的研究表明，胶原蛋白Ⅰ、透明质酸以及阿司匹林复合的钛面不仅有利于骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和分化，还可减少巨噬细胞对炎症的反应，同时还发现种植体周围骨结合的发生明显增强，因此认为胶原蛋白Ⅰ、透明质酸和阿司匹林修饰的种植体表面可调控骨结合和成骨免疫的发生。提示胶原蛋白Ⅰ和透明质酸复合修饰的种植体有应用于骨质疏松患者的潜力。

有研究采用天然胶连剂和原花青素将胶原蛋白Ⅰ固定于氧化锌种植体表面也显示出良好的成骨效果[26]。胶原蛋白Ⅰ附着于镁-氧化锆-钙合金制成的种植体表面，种植体周围新骨的生成也明显增多[27]。

以上研究表明，胶原蛋白Ⅰ加快骨结合发生的作用明显，胶原蛋白Ⅰ修饰的种植体可运用于骨质较差的种植区域，并能作用于上皮细胞，促进牙龈软组织愈合，提示胶原蛋白Ⅰ能适当拓宽种植的适应证，提高种植体的成功率，延长种植牙的使用寿命。

3 BMP-2

BMP是转化生长因子-β超家族成员，可由成骨细胞分泌，能促进间充质干细胞分化为成骨细胞或破骨细胞。

BMP-2附着于金属种植体表面的方法有很多，主要有:采用磷酸钙作为载体，与细胞外基质或壳聚糖混合；以肝素作为连接体；采用聚合电解质作为载体；BMP-2基因转染以及采用纳米管作为载体等[2]。有学者将纳米微管和BMP-2联合运用钛片表面发现，成骨细胞的黏附、增殖、分化和成骨能力均有所增加[8]，运用纳米微管的BMP-2种植体表面也可明显加快种植体周围骨结合的发生[28]。

研究发现，BMP-2促进了成骨细胞的分化、加快了骨结合的发生，可能是通过激活整合素和BMP/Smad通路实现的[29]。Böhrnsen等[30]发现，在骨质疏松大鼠模型中，BMP-2还可加快骨缺损的愈合，并在一定程度上加强种植体表面骨结合的强度。

Peterson等[31]研究发现，相对于纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)，BMP-2具有更好的成骨效果。为研究BMP-2在种植体表面的稳定释放对成骨的影响，Hunziker等[32]将BMP-2置于一种类似于骨材料的三维晶体中，与磷酸钙一起涂布在种植体表面，实验结果显示缓慢、持续释放BMP-2有助于种植体周围成骨，使成骨的过程更加安全、可靠，可缩短种植术后的愈合期。Yang等[33]认为，BMP-2和人生长分化因子-5在分子结构上有与肝素结合的特殊位点。有研究探索了BMP-2和人生长分化因子-5这两种细胞因子联合运用对成骨效应的影响发现，成骨细胞MC3T3-E1在人生长分化因子-5和BMP-2共同修饰的界面上表现出了较高的增殖率、碱性磷酸酶活性，同时胶原蛋白Ⅰ和骨桥蛋白信使RNA的表达也明显高于单独使用分化因子-5和BMP-2组，提示人生长分化因子-5和BMP-2联合使用能明显加快成骨细胞的成骨效应。也有研究联合运用DNA寡核苷酸和BMP-2也取得了较好的骨诱导效应[30]。

比较BMP-2/羟磷灰石复合物和临床上常用的牛骨制作的人工骨粉的成骨作用发现，BMP-2/羟磷灰石复合物的骨诱导作用较好[34]。另有研究发现，BMP-2能促进放射治疗后种植体表面骨结合的发生，且BMP-2与血管内皮生长因子联合使用时效果最佳，提示BMP-2有适当拓宽临床种植适应证的潜力[35]。

BMP-2附着于种植体表面的量可能也会影响骨结合的效率。Guillot等[36]研究了大剂量BMP-2(9.3 μg)对成骨效应的影响发现，BMP-2修饰的种植体表面的骨整合效果明显低于无BMP-2附着组，但是在BMP-2修饰组中种植体上部的空心部位却显示出了相对较高的骨生长，由此认为大剂量的BMP-2可能会导致局部、暂时的骨损坏，涂布在种植体上的BMP-2的剂量需要谨慎选择。有学者认为，种植体表面BMP-2为15 μg时效果较好[37]。

近年来有学者对BMP-2促进骨结合发生的作用提出了质疑，研究发现，将BMP-2附着于种植体表面并不能促进新骨形成和加快骨结合发生[38-40]。有研究将涂布BMP-2的种植体植入骨缺损动物的牙槽骨中，并同期植入异体骨移植材料发现，BMP-2修饰组种植体的机械强度和骨移植材料的吸收率均弱于对照组，提示BMP-2并不适用于植骨并同期种植手术[41]。

BMP-2可有效加快种植体表面骨结合的发生，而其与另一种支架材料(羟磷灰石、磷酸钙)的联合运用是近年来学者们研究的热点，但也有学者对此提出了质疑。

4 纤连蛋白

纤连蛋白是细胞外基质蛋白的一种，细胞内含有RGD肽链，可与细胞表面的整合蛋白结合，促进细胞与生物材料的黏附。纤连蛋白修饰的钛片可促进成骨细胞增殖、分化和矿化[42]。

Rapuano等[7]将成骨细胞置于纤连蛋白修饰的钛片上培养，结果发现，培养最初10 d成骨细胞增殖的最快，第10～20天成骨细胞的分化能力开始增强，第20～36天成骨细胞的矿化能力最强。Cho等[43]的研究显示，纤连蛋白来源的寡肽的促成骨作用可能与细胞外调节蛋白激酶信号通路有关，可作为一种稳定的生物分子用于种植体表面改性，以促进成骨作用的发生。在动物实验中，Agarwal等[44]将纤连蛋白附着的种植体植入小鼠颌骨中，结果发现，种植体的稳定性在第1个月和第3个月时与对照组相比分别提高了57%和32%，证实了纤连蛋白附着的种植体可加快骨整合的发生[45-46]。此外，MacDonald等[47]的研究也发现，与对照组相比，纤连蛋白附着的种植体的抗剪切能力提高了3～5倍。

Horasawa等[42]将纤维蛋白原和纤连蛋白复合在钛板表面，将成骨细胞置于这种界面上生长，与对照组相比，成骨细胞的增殖率明显增高，BMP的表达量也明显增加。提示纤链蛋白修饰的钛表面可促进骨形成，从而加快种植体与骨的整合。纤连蛋白与BMP-2的复合使用对骨整合的发生也有积极作用[48]。Brigaud等[49]比较纤连蛋白/BMP-6和纤连蛋白/BMP-2的成骨效应的研究发现，纤连蛋白/BMP-6促骨整合的效果最好。另有研究比较磷酸钙和纤连蛋白共同修饰的种植体与酸蚀处理的种植体的成骨效果发现，磷酸钙和纤连蛋白共同修饰的种植体表面的骨结合较好、骨密度较高[50]。此外，有研究还比较了线性RGD、环状RGD与纤连蛋白的成骨效果发现，纤连蛋白可有效促进成骨细胞附着于钛片，加快成骨作用的发生[51]。

以上研究证实，纤连蛋白可加快成骨细胞附着于钛片或种植体表面，加快骨结合的发生，纤连蛋白与其他生长因子/蛋白的联合应用是近年来学者的研究热点。

5 层粘连蛋白

层粘连蛋白是一种属于细胞外基质蛋白的糖蛋白，能与细胞外的整合素结合，可通过整合素β1调节细胞的黏附作用，招募成骨细胞聚集。有研究者发现，层粘连蛋白-1有促进磷酸盐成核的作用[52]。

Bougas等[53]将层粘连蛋白-1和种植体复合后植入家兔的股骨中，结果显示，层粘连蛋白-1能明显增强种植体周围骨的整合。Schwartz-Filho等[54]将层粘连蛋白-1和种植体复合后植入家兔的胫骨中发现，成骨细胞的标志物成骨特异性转录因子-2、骨钙素、碱性磷酸酶、胶原蛋白原-1基因的表达明显升高，提示层粘连蛋白-1可加快种植体表面新骨的生成。此外，Atsuta等[55]发现，层粘连蛋白附着的种植体可加快上皮与种植体的结合，形成良好的生物学封闭，提高种植体的种植成功率。Min等[56]的研究显示，层粘连蛋白-1可促进成骨细胞黏附，缩短种植体植入后的愈合时间。Heller等[57]研究也发现，采用等离子聚合的方法将层粘连蛋白修饰于钛表面，可延长生物分子的作用时间。还有研究发现，层粘连蛋白-2来源的肽DLTIDDSYWYRI修饰的种植体可加快骨结合的发生[58]。Yeo等[59]的研究也发现，层粘连蛋白-2来源的肽Ln2-LG3-P2-DN3可加快成骨分化，并加快种植体周围新骨的形成。

以上研究表明，层粘连蛋白及其来源的肽均可加快种植体周围骨结合的发生，提示层粘连蛋白有运用于种植体周围生物化学改性的潜能。

6 釉原蛋白

釉原蛋白存在于造釉细胞和釉质界面上，具有促进细胞黏附的作用。Beyeler等[60]将釉原蛋白的活性位点缩短为一条含13个氨基酸的肽链，这段肽链不直接与细胞外的受体结合，而是先与纤连蛋白交互，再与细胞外的受体结合，因此认为这段活性肽链附着的种植体表面能促进纤连蛋白的集聚，然后促进细胞在种植体表面黏附，加快骨结合的产生。Du等[61]将成骨细胞置于釉原蛋白和磷灰石复合的钛片上培养发现，细胞的黏附、增殖和分化能力均有所增强，提示釉原蛋白有运用于口腔种植和生物材料等领域的潜能。

在动物实验方面，Terada等[62]的研究也证实了釉原蛋白不仅可加快牙髓干细胞黏附在钛片上，还能增强其分化能力，同时还发现釉原蛋白附着的种植体可促进种植体周围骨结合的发生。

7 其 他

弹性蛋白可促进上皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞的黏附和增殖[63-64]。Raphel等[64]发现，弹性蛋白可加快成骨细胞附着于钛面，并促进其分化和矿化。体外实验发现，植入早期(1周)，弹性蛋白修饰组的骨-种植体接触面积和界面强度均高于对照组[65]。

玻连蛋白是一种细胞基质蛋白，可与生长因子、蛋白酶和蛋白酶抑制剂/受体相互作用。Ravanetti等[66]将一种类似于玻连蛋白的多肽附着于种植体表面，并植入大鼠股骨中发现，骨结合的发生明显高于对照组，认为这可能与玻连蛋白能加快种植体表面成骨细胞的募集和激活有关。此外，有研究将成骨细胞置于黏附玻连蛋白和纤连蛋白的钛片上培养，结果发现，成骨细胞的黏附、增殖能力均有所增强[67]。

DNA是一种生物大分子，可组成遗传指令，DNA分子的功能是贮存决定物种的所有蛋白质和RNA结构的全部遗传信息，能表达生物活性蛋白的DNA也可加快成骨细胞的增殖和分化。Jiang等[68]将BMP-2的DNA通过一定的方法复合到钛板表面，将MC3T3-E1细胞置于这种界面上生长，结果发现，MC3T3-E1细胞能分泌BMP-2，并且在成骨分化早期BMP-2分泌的最多。Hu等[69]研究发现，壳聚糖和含有绿色荧光蛋白及人BMP-2基因的质粒DNA复合修饰的钛面，有助于间质干细胞分化为成熟的骨细胞。

8 小 结

钛基种植体表面的生物化学改性不仅能提高种植体周围的骨结合，若联合运用具有促成骨作用的生物蛋白因子与具有抗菌性能的肽链，还可降低细菌的黏附和增殖。目前多方向、多种蛋白因子联合应用(如采用层层自组装技术将壳聚糖和BMP-2同时加载于种植体表面)，进一步提高种植体周围组织的骨结合和抗感染能力是当前的研究趋势。目前国内外关于此方面的报道大多基于动物实验与体外实验，如运用于临床，还需要更进一步研究如何控制生物分子在种植体表面的稳定释放。