肠道微生态与肝硬化

宦 徽 刘 超 唐承薇

人体肠道内定植有大量微生物，以细菌为主，同时也包括古生菌、病毒、原生动物等其他微生物。肠道菌群作为人体内最大的微生物贮藏库，可与宿主互利共生，一定程度上影响人类的生理健康状况。在健康的人体中，肠道菌群可帮助人体消化食物，提供丰富的必需营养物质(如生成维生素、增加必需营养物质的生物利用度等)，抵御肠道病原体入侵、与黏膜免疫系统相互作用，发挥免疫调节作用等。因此，人体内的肠道菌群可被看作为一个虚拟但又必不可少的“器官”。

传统的观念认为健康的人类胚胎在无菌环境中生长。近期有证据表明，孕期子宫内的羊水就已存在细菌，尽管其数量较少、微生物多样性相对欠丰富[1]。出生后，新生儿所接触的微生物及其衍生物持续暴增。不同的生产方式，极大地影响了新生儿的微生物群落组成。此外, 人体宿主的遗传背景、年龄、免疫系统的发育、药物、饮食习惯如饮酒、吸烟等因素均可影响肠道菌群的组成和功能。人体微生物作为相互作用的动态体系，具有极为复杂的特点，不仅个体间存在菌群多样性，甚至同一个体的不同部位肠道菌群的构成也存在一定程度的差异。

正常成人肠道微生物呈相对稳定状态，这种状态一直持续到老年。总体来说，成人体内微生物总数多达40000种，其总体基因组比人类基因组超出100倍。其中在菌门层面上，拟杆菌门和硬壁菌门为健康成人的主要菌门。目前越来越多的证据显示，肠道菌群失调如肠道微生物种属丰度、多样性和(或)组分改变均可能导致多种疾病的发生，如一系列的肝脏疾病、原发性硬化性胆管炎、炎症性肠病等[2～4]。不同的疾病是否显示了相对独特的肠道微生物组变化，尚需开展深入的研究进一步明确。

一、肠道菌群的研究方法

人们对成人肠道菌群的认识最早来源于传统微生物培养方法，然而此方法敏感度低，且目前有超过70%的细菌因难以鉴定种属或不能提供优化的培养生长环境而无法培养。因此，仅仅依赖于微生物培养的方法不足以彻底了解肠道固有菌群的完整情况。近年来，DNA测序和分子生物学的快速发展，使得微生物16s核糖体RNA基因序列分析成为微生物研究的主要方法。而高通量测序技术的出现，不仅能够完整地描述复杂的微生物组分，同时使大规模发现新的微生物群成为可能。而基于大规模人群的全微生物组——人类微生物组计划可从肠道菌群结构及功能代谢方面出发，整体宏观的深入研究健康成人肠道微生物组情况。

在肠道微生物的系统进化研究中，肝硬化菌群失调比例(the cirrhosis dysbiosis ratio, CDR)被用来判断定值菌和非定值菌的比例，即有益菌与侵袭菌之比[5]。其中以双歧杆菌与肠杆菌比值评分体系最为常用，其比值能有效区分肝硬化与健康成人，而且还可用于评估肝硬化患者出现并发症的风险，因此目前被广泛运用于临床试验中。

二、肝硬化中的肠道微生物

肝脏与消化道相邻，70%的供血来自于门静脉，这一特殊的解剖位置(肝-肠轴)，可导致肝脏特异性与经消化道运输的营养物质相互作用，持续暴露于大量的细菌及其产物中。在肠道菌群分类构成方面，大量研究显示，不同病因所致的肝硬化患者不仅具有相似的粪便肠道微生物群落，而且与健康人比较，肝硬化患者肠道菌群普遍表现为有益菌(如毛螺菌科、拟杆菌门)减少，同时潜在致病菌比例增多(如链球菌、肠杆菌科、肠球菌科、葡萄球菌科等)[6～10]。其中，基于中国汉族人口的一项研究发现，肝硬化患者肠道菌群的最大改变是口腔细菌菌种大量侵入消化道，推测可能与胃酸分泌减少，防御屏障破坏有关[9]。还有研究发现,肝脏疾病恶化时，肝硬化患者的肠道菌群也会随之改变，其中微生物基因组中丰度较高的细菌种属与疾病的严重性有明显关系[11]。笔者推测肝硬化的疾病分期或许是决定微生物组成分丰度的一个重要因素。值得注意的是，在酒精性肝硬化患者的大便中发现普雷沃菌科基因丰度高于乙肝相关性肝硬化患者[12]。推测酒精相关性病因或许可影响终末期肝脏疾病患者的肠道菌群组成，但这一推断需进一步的研究证实。

此外，国内的一项研究通过宏基因组定量分析显示15个肠道微生物基因具较高的特异性，因而推荐这些微生物基因用来作为肝硬化的生物诊断指标，这或许可为肝硬化的监测和预防提供新的思路[9]。然而，考虑到缺乏这些微生物基因在不同疾病中的敏感度和效益研究，因此真正将肠道菌群作为肠内或肠外疾病诊断的生物学指标或药物疗效的评估指标，还有一定的距离，需设立更多合理的临床研究。

其次，传统观念中的有益菌如厚壁菌门中可能存在致病菌，如葡萄球菌科和肠球菌科，这两者在肝硬化患者中的基因表达丰度异常增多，因此有研究认为对于肠道菌群基于菌门水平的分析不适于肝硬化的微生物组研究[13]。目前的临床研究之间，在研究方法上无统一标准，如研究收集的标本从大便样本、肠腔抽吸物、肠道分泌物、肠道黏膜,到唾液等均有涵盖。其中，大便标本因容易收集，故在肠道菌群的研究中最为常用，但往往仅能反应肠腔内微生物情况。而肠道黏膜的微生物作为肠道生物膜结构，与其下的肠道上皮层密切接触，更能反映肠道固有定植菌特点。肠道黏膜表面黏附微生物和管腔内微生物组成存在区别，且可能在生态系统中发挥不同的作用。因此，基于不同人体样本的临床试验，可导致不同研究之间微生物组构成分析产生异质性。

还需注意的是，在细菌基因水平上，肝硬化的病理特征或许应从微生物组基因丰度变化和功能两方面进行具体描述，然而目前的研究多侧重于肝硬化患者肠道菌群的宏观构成，存在功能研究明显不足。肝硬化与肠道微生物之间的关系，是互为因果，亦或是肝脏疾病调控肠道细菌改变，或是肠道菌群失调是导致肝硬化的发生原因，目前尚无定论。

三、肠道菌群在肝硬化中的机制研究

1.胆汁酸代谢:胆汁酸的肝肠循环可介导肝脏和肠道相互联系，即初级胆汁酸在肠道细菌的作用下转化为次级胆汁酸，由末端回肠重吸收回肝脏，再与结合胆汁酸一同经胆道排入肠道。例如拟杆菌属可产生胆酸盐水解酶，后者可促进初级胆汁酸转化为次级胆汁酸。这一过程，同时也为拟杆菌属细菌提供了能量。然而，在进展期肝硬化患者的粪便中，总胆汁酸的含量较正常人减少了5倍，其中次级胆汁酸与初级胆汁酸比例下降的最为明显[14]。目前认为因进入肠道内的胆汁酸减少，导致如肠杆菌科等致病菌群和促炎性微生物组过度生长，而依赖于脱羧基功能的菌群减少[15]。此外，韦荣球菌属在肝硬化患者中的异常增多，可水解聚合的胆盐，阻碍肠道中微胶粒形成，最终导致消化道中的脂肪酸等脂肪代谢产物不易被肠黏膜吸收，胆汁进而淤积，最终加重肝硬化。胆汁酸的微生物调控作为肠道微生物与宿主相互作用的重要机制，除了影响肝脏疾病，同时也参与代谢综合征的发病过程。

2.小肠细菌过度生长:目前的研究发现在肝硬化患者中，总胆汁酸减少可能导致小肠细菌过度生长的发生。如在肝硬化大鼠模型中，予以结合胆汁酸治疗的大鼠，可出现肠道细菌过度生长和细菌移位明显减少的现象。小肠细菌过度生长作为在肝硬化患者中常见的现象，其病理因素除胆汁酸减少这一原因外，还包括小肠蠕动异常，肠道转运延迟，肠道通透性增加，抗菌防御减弱，小肠细菌过度生长等。此外，小肠细菌过度生长还与内毒素血症、病理学细菌移位的发生有关，不仅可导致肠道细菌感染如自发性细菌性腹膜炎的发生率升高，同时还可增加肝脏疾病失代偿的风险[16]。

3.病理性细菌移位:细菌移位被定义为活微生物或其产物如脂多糖、细菌DNA等通过肠道屏障从肠腔迁移进入肠系膜淋巴结及其他肠外器官。虽然目前的观点将小肠细菌过度生长视为促使病理学细菌移位发生的主要因素，然而在肝硬化动物模型中仅仅出现小肠细菌过度生长，不足以导致细菌移位的发生。还需连同其他因素如局部免疫下降等，协调作用最终才可导致这一病理过程的发生。移位的细菌最为常见的为肠杆菌、粪肠球菌属和变形菌属等[16]。移位的细菌及其片段可通过释放细胞因子和一氧化氮引发炎性反应，最终导致血流动力学的紊乱。而肠道内固有定植菌的减少，可导致短链脂肪酸、抗菌肽合成减少，肠道黏膜屏障相应遭受破坏，进而引起一系列病理反应如炎症、门脉高压等出现。

4.内毒素：肝硬化患者中肠道细菌过度生长及细菌移位均可导致韦荣球菌属和肠杆菌科在结肠中显著增多。革兰阴性菌的异常增多可导致内毒素生成明显增加。肝硬化患者因肝脏库普弗细胞清除功能降低，消化道通透性增加，连同门-体侧支循环形成，均导致血中内毒素水平明显升高。

5.其他因素如全身性和局部性免疫防御受损可能也参与这一机制过程，但目前相关的研究较为匮乏，且缺少相应有效的研究方法。事实上，肝硬化患者菌群失调的风险较高，推测可能是多因素协调作用的结果。

四、肠道菌群在肝硬化的主要并发症中发挥的作用

1.肝性脑病：人们对肠道菌群在肝脏疾病中作用的了解，最早来源于肝昏迷与肠道的含氮代谢产物之间存在联系的发现。目前在肝硬化肠道微生物的研究中，大部分研究都侧重于对肝性脑病的研究。总体来说，有肝性脑病病史的患者的大便和唾液样本中均发现非固有定植微生物数量增多，而固有定植微生物数量减少的现象[7,11]。进一步研究发现，产碱菌科或卟啉单胞菌增多与HE患者所表现出的认知能力差明显相关；而肠杆菌科与肝性脑病患者的炎症有强相关性[6]。还有研究发现肠球菌、巨型球菌、克雷伯菌属与肝性脑病患者的认知能力和炎性反应有关[7]。有趣的是，在动物模型中定植有某些细菌的肠道微生物能够通过影响神经元回路参与对运动和行为的控制[17]。通过微生物-肠道-脑轴，肠道细菌可通过生成氨以及内毒素驱使的炎性反应，协同参与肝性脑病的发展过程[18]。此外，还有研究认为微生物产生的物质如酚类、短链或中链脂肪酸等可能也参与这一发病过程[19]。

2.自发性细菌性腹膜炎：肠道中细菌过度生长和(或)肠道细菌移位被认为是自发性细菌性腹膜炎的重要发病机制。研究发现，尽管这些肝硬化患者的腹腔积液微生物培养为阴性且未被诊断为自发性细菌性腹膜炎，近50%的酒精性肝硬化患者的腹腔积液中可检测出细菌DNA，且与在肝脏标本中所发现的移位细菌一致[8]。目前认为，引起自发性细菌性腹膜炎的细菌大都为革兰阴性杆菌如大肠杆菌和肠杆菌科的部分成员[6,12]。

五、治疗措施

1.抗生素:在肝硬化的管理中，调控肠道微生物是一种可取的治疗手段，现阶段的研究多偏重于对肝性脑病的疗效分析。目前主流的治疗手段是使用吸收较差的抗生素如诺氟沙星和利福昔明以达到肠道净化的作用[5]。诺氟沙星不能完全被肠道吸收，对需氧性革兰阴性菌敏感，且很少引起耐药。而利福昔明全身毒性弱、不易耐药，可调节革兰阳性菌，减少肠道细菌产生脂多糖。在动物模型中，与对照组小鼠比较，使用利福昔明治疗的小鼠门脉压降低，肝纤维化程度明显降低[20]。临床试验中也发现利福昔明在肝性脑病和亚临床肝性脑病中可明显改善患者的认知功能，并减少肝性脑病的发生[21]。自从美国药品监督管理局批准利福昔明可用于治疗肝性脑病以来，人们对利福昔明更为关注。然而有研究发现利福昔明并不能改变肠道菌群本身，推测其疗效可能归因于对致病菌产生的代谢产物的调节作用[22]。因此，为明确这些抗生素在肝脏疾病中对微生物组和微生物-宿主相互作用的具体作用及影响，尚需更多的研究去明确。

2.益生菌:近几年来越来越多非抗生素治疗手段被应用于肝脏疾病，如益生元(食物补充或直接添加)、益生菌等。其中，益生菌作为目前研究的热点，其疗效的主要机制包括调节肠道微生物及改善肠道屏障等作用机制。尽管在肝前性门脉高压动物模型中，乳酸菌发酵的奶制品没能达到有效减少细菌移位发生的研究结局。然而，在轻症肝性脑病动物模型中，研究发现益生菌混合物能够有效降低肝性脑病的发生，降低血氨和内毒素水平，并且可明显缓解肝脏损伤和炎性反应[22]。近期基于临床随机对照试验的Meta分析显示，益生菌在治疗肝性脑病中存在一定的希望，但因不同研究之间存在明显的偏移及随机误差，尚不能明确得出益生菌有效的结论。目前的研究之间存在益生菌使用浓度、疗程、肝脏疾病严重性异质的现象，且缺乏益生菌对特异性肠道菌群组分影响的研究。因此，进一步的临床试验需着重研究益生菌对肠道微生物具体成分的影响与其临床疗效的相关性分析，并最终明确益生菌在肝脏疾病中的最佳有效剂量。

六、展 望

肝硬化患者菌群失调的风险较高，考虑与多因素协调作用的有关。肠道菌群在肝硬化的主要并发症中发挥着重要作用，然而目前大部分研究仅停留在微生物的变化这一表观现象，且主要集中在属水平层面。精准到种水平的宏基因组学将是未来研究的重要方法，这可为展现肝硬化肠道微生物的多样性、功能活性、种群结构、进化关系等提供更多细节信息。联合蛋白及代谢组学等方式，可进一步探究肠道菌群在肝硬化中的机制作用。益生菌在治疗上目前尚不能得出明确有效的结论。因此有赖于更多随机、大样本、多中心、高质量的研究，分析益生菌对肠道微生物具体成分的影响与其临床疗效，为临床提供更多可靠依据。