转化生长因子5在发育性髋关节发育不良中的作用研究进展

姚佳炜, 邱波

武汉大学人民医院骨科, 武汉 430060

发育性髋关节发育不良(DDH)是一种十分复杂的发育障碍，是指股骨头和髋臼的大小、形状、方向或软组织的异常所导致的脱位或半脱位。儿童先天性的髋关节发育不良可造成股骨和髋臼周围组织如软骨、滑膜发育的异常，进而引发早期骨关节炎(osteoarthritis，OA)，致使患儿的双侧下肢疼痛、畸形甚至残疾；青壮年期的髋关节发育不良会引起病患步态的异常、两侧肢体的力量和长度不等、脊柱侧凸及膝关节炎，严重影响患者的生活质量[1]。早期诊断患DDH的新生儿可通过简单的夹板治疗获得较好的、安全的疗效；但若闭合复位失败，或年龄大于18个月的幼儿则需要进行外科手术。但是对于DDH儿童，多种切开复位型外科手术都有引起后续的股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，FHO)的风险，这也是医源性的严重的并发症之一，且难以治愈[2]。而出生时髋关节全脱位发生率为0.1%～0.5%，半脱位与发育不良的发生率为1%，超声筛查报告筛查人群发病率为2.5%～5%[3]。因此，早期预防和诊断是治疗DDH的关键。

早期专业的临床体格检查对于DDH的发现具有重要意义。目前动静态的超声检查是诊断DDH的主要手段，但对于新生儿与儿童的体格检查则需要专业经验较高的专家进行筛查，这是由于超声检查无法评估患儿的预后，可能造成一些无DDH危险因素且预后较好的患儿因医务人员主观诊断的偏差而选择不恰当的过度治疗[2]。DDH会影响一个家庭的多个成员，并且具有较强的遗传基础，现有研究表明此种疾病具有不完全外显率的常染色体显性遗传模式[4]。通过基因谱分析可筛选出与DDH相关的易感基因，再用超声检查筛选具有易感基因患儿，从而改善单纯应用超声检查所造成的医务人员选择过度治疗方案的问题[2]。现已通过关联研究筛选出了许多易感基因，如PAPPA2、COL2AL、HOXD9、GDF5和TGFBI，这些基因的发现有助于预防DDH患者进一步的发展[5]。其中，Hatzikotoulas等[4]通过鉴定GDF5启动子变异与DDH之间的复制证据，已确定GDF5与DDH之间的关联。

转化生长因子-β家族(transforming growth factor-β，TGF-β)是由哺乳动物33个基因编码的，其在控制细胞增殖、分化，伤口愈合和纤维化等方面具有多重作用[6]。GDF5属于TGF-β家族的一员，可促进软骨和骨的发育、修复与维持，并且与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)密切相关[7]。BMPs为骨衍生物中的骨诱导成分，在各种器官(如骨、血管)、组织(如软骨、骨骼肌)的形成和维持中起重要作用[8]。因此，早期发现患儿GDF5基因的缺失、增强、替换等变异对于DDH发现和诊断具有重要意义，对于其治疗也有一定的指导作用。基于此，本文主要讨论GDF5基因及其调节基因在DDH发病机制中产生的作用，以及如何利用GDF5制定针对DDH的治疗方案，以期为DDH的临床治疗提供新的策略。

1 GDF5在基因层面对DDH的影响

1.1 GDF5的基因型

GDF5位于20号染色体的20q11.2上，GDF5基因的5′非翻译区(5′-untranslated region，5′UTR)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点rs143383和等位基因的存在与DDH密切相关。Dai等[9]在病例对照研究中发现GDF5SNP与汉族人群中的DDH相关联，随着T等位基因频率的显著增加，其DDH的严重程度也随之增加，表明GDF5SNP与DDH的严重程度相关。近期Sadat-Ali等[10]收集分析了473份沙特阿拉伯人的血液样本，其中100份来自于已被确诊为DDH患者的血液样本，200份来源于其父母，73份来自于其兄弟姐妹，100份源于健康者，来研究患者基因型与亲属基因型的关联性。研究发现TT基因型与CC基因型相比具有更高的发展为DDH的风险，而且首次发现基因型TT和T等位基因在患者与其父亲中过度表达。因此，GDF5中TT基因型的胎儿在出生后有患DDH的风险，且父系间的遗传效应更为明显，风险也更高。

1.2 GDF5基因SNP位点rs143383缺陷

位于GDF5基因的上游5′UTR中rs143383的C至T对编码GDF5具有功能性，其对于骨骼肌肉系统的作用具有多重性，与膝髋关节炎、DDH、腰椎间盘退变和肌腱病变相关[11]。GDF5基因SNP位点rs143383缺陷导致GDF5的减少，GDF5与BMP受体Ⅱ型、BMP受体ⅠB型和BMP受体ⅠA型的结合减少，从而阻碍了Smad1/5/8的磷酸化。而磷酸化的Smad1/5/8可与Smad1/4复合，此复合物易位到细胞核可调节靶基因的转录[12]。这些靶基因包括COL2AL和ACAN，负责编码软骨主要结构蛋白的Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖等。GDF5的减少阻遏了软骨细胞的形成与发育、肌腱和骨骼的愈合，从而成为DDH的风险因素。这也提示了GDF5基因中5′UTR SNP位点rs143383的缺乏会导致膝髋关节软骨与滑膜的发育不良，进而引起患儿在早期发育中形成DDH。因此，外源给予GDF5为减轻DDH或OA遗传缺陷提供了治疗的可能[13]。

1.3 GDF5/CDMP-1基因表达的增强

作为GDF5的同源物，软骨源形态发生蛋白-1(cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1)能够促进软骨细胞的肥大与增殖，并且在四肢骨骼的纵向生长和软骨形成的空间结构化模式中起关键作用。Tsumaki等[14]通过对转基因小鼠导入3种不同的启动子/增强子重组CDMP-1序列(742-CDMP1/742-CDMP1-Int/COL2A1-CDMP1)来研究转基因小鼠的表型变化，结果发现3种CDMP-1的转基因小鼠都显示软骨发育不良、软骨细胞增殖并向肥厚型软骨细胞分化;转基因小鼠在体型与骨骼畸形程度上因表达水平的不同而存在差异；转基因小鼠在远端骨骼上的扩张比近端更加突出。这种GDF5的人类同源物CDMP-1可调节骨骼元素的形成、生长和分化，控制着肢体远端部分骨骼如四肢、髋膝关节等软骨的发育和空间构象。在人类正常发育中，GDF5/CDMP-1不在脊柱中表达，只调节肢体远端的骨骼形状和大小，而且在人类中BMP独特的表达模式和特定的受体亲和力在不同骨架成分的形成中起重要作用，即BMP的空间调节作用[14]。GDF5/CDMP-1基因表达的增强会造成四肢骨骼(如股骨)的肥大、髋关节囊的异常，最终造成其髋关节的脱位及半脱位。

1.4 DNA的高度甲基化

GDF5的DNA甲基化在表观遗传学上与DDH易感性有关。表观遗传学是一种不改变DNA序列只影响基因表达的过程。甲基(CH3)通过DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)，转移到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶。Baghdadi等[15]挑选45名DDH患者和45名健康患者的股骨颈软骨进行DNA的甲基化分析对照，发现DDH患者的GDF5启动子高度甲基化，这种甲基化导致GDF5的表达降低。位于GDF5基因的5′UTR的甲基化所引起的rs143383等位基因的表达失衡是由阻遏蛋白SP1、SP3和DEAF1所介导的。SP1、SP3和DEAF1阻遏蛋白抑制GDF5的表达，SP1抑制rs143383中T等位基因比C等位基因作用更强，而SP3抑制C等位基因作用比T等位基因更为明显。在5′UTR甲基化时，SP1、SP3和DEAF1减弱了对等位基因的差异性抑制[11]。因此，在5′UTR甲基化下，GDF5的T等位基因相对于C等位基因被抑制的作用减弱，表现为相对增强，从而形成TC型基因型,与TT型基因型的儿童具有相同的患病风险。

1.5 GDF5的调节基因SOX基因

SOX(SRY-related high mobility group-box gene)基因调节许多细胞类型的规范和分化，在睾丸、中枢神经系统、少突胶质细胞、软骨细胞和神经嵴细胞的发育中起着重要作用，其中，SOX9基因编码的蛋白是调控软骨在各阶段发育过程中的主要调节因子[16]。研究表明，SOX5基因的过表达会显著增强基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)基因的表达，从而促进软骨细胞外基质的降解，造成软骨组织结构的破坏、关节内畸形，直至发展成DDH。Kan等[17]研究SOX基因过表达的小鼠前软骨细胞系ATDC5与人宫颈癌Hela细胞来检查GDF5启动子的转录活性，发现SOX4、SOX11、SOX12基因对GDF5启动子具有较强的活性，其中SOX11的作用最强。将SOX11引入逆转录病毒并感染软骨形成ATDC5和成纤维细胞中，GDF5蛋白的表达增加；相反，抑制逆转录病毒的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)抑制ATDC5细胞中内源性SOX11活性，GDF5mRNA的水平被抑制[17]。SOX蛋白家族与GDF5基因的结合位点位于GDF5基因的5′UTR区域中，以调节GDF5基因的转录活性[18-19]。在关节的形成过程中，Wnt9a/β连环蛋白与GDF5蛋白基于对软骨细胞的作用，从而调控关节软骨组织的分化和维持关节形态发育中关节空间的稳定[20]。关节软骨组织的形成是由内分泌蛋白GDF5刺激软骨细胞形成的，SOX11蛋白是通过增强GDF5表达来促进关节软骨成熟，是关节发育后期所涉及的蛋白之一。检测在全膝关节置换术后小鼠和人类样本的膝关节炎试验模型的表达模式表明在降解的软骨组织中，SOX基因家族的表达也降低[17]。SOX基因表达的增强或减弱既可直接影响关节内软骨的发育，又可通过调节GDF5启动子的活性，来调控软骨细胞的增殖与分化。因此，SOX的异常表达可造成关节内软骨的发育不良，是DDH在基因水平上的潜在发病因素之一。

2 基于GDF5的DDH治疗策略

2.1 rhGDF5关节内注射

作为胚胎早期关节形成发育标记物，GDF5参与维持骨修复和软骨发育，并在滑膜关节发育中起重要作用[21]。而GDF5基因的突变和缺陷也会导致软骨的发育不良，从而阻止正常的骨骼发育并产生严重的关节病变。在关节内直接补充重组人GDF5(recombinant human GDF5，rhGDF5)潜在激活合成代谢反应以预防疾病进展和促进软骨修复，可作为一项治疗OA和DDH的方法。Parrish等[22]对大鼠实施内侧半月板切除术以建立大鼠内侧半月板横断(medial meniscus transection，MMT)关节不稳定OA模型，同时对照组给予关节内注射具有甘氨酸缓冲液的海藻糖溶液，干预组给予关节内注射rhGDF5。结果显示对大鼠关节内注射rhGDF5可显著刺激软骨修复，且疗效与其注射剂量相关。因MMT大鼠模型中软骨的修复对rhGDF5关节内注射剂量和注射方案的依赖性作用，给药剂量范围和其他注射方法需要进一步的研究。这一研究成果也提示rhGDF5具有治疗髋关节发育不良的潜力。

2.2 硫酸乙酰肝素与GDF5作用

研究表明，GDF5能够刺激聚集蛋白聚糖基因的表达但不会增强Ⅹ型胶原蛋白的表达[23]。这一特性使其成为关节软骨改善组织工程策略的靶标。硫酸乙酰肝素是由交替的葡糖胺和糖醛酸残基组成的线性多糖，它与多种蛋白质配体相结合而使其呈递、保护、寡聚化或构象激活，从而对蛋白质配体产生多种影响[24]。Ayerst等[25]通过研究肝素在临床和组织中的应用发现肝素可抑制细胞表面硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)与GDF5的结合，并抑制GDF5诱导的Smad1/5/8信号的传导，而HS蛋白聚糖对于GDF5定位于细胞并诱导间充质细胞衍生为软骨细胞至关重要。HS能够将GDF5定位于骨骼细胞系细胞上，并且会刺激聚集蛋白聚糖的表达而不会影响Ⅹ型胶原蛋白的表达[25]。这一研究有助于指导临床同时使用肝素与硫酸乙酰肝素，也为诱导基质细胞分化为正常软骨细胞而不是形成肥大细胞提供了方案，即为治疗因软骨细胞发育异常引起的DDH给予了治疗方向。

2.3 GDF5基因修饰干细胞

关节软骨的发育不良、外伤、缺损和老化可能会导致严重的临床问题，如髋关节软骨的发育不良致使髋关节的脱位及半脱位等。基质相关的自体软骨细胞移植(matrixassociated autologous chondrocyte transplantation，MACT)是目前用于治疗创伤性软骨缺损的最有效的方法之一[26]。在各种移植细胞的来源中，脂肪来源干细胞(adipose stem cells，ADSCs)因具有较高的产量和便于收集的优点，而被认为是一种既易获取又易培养的优质干细胞[27]。Yang等[28]用携带GDF5的腺病毒感染hADSCc以建立带有GDF5基因的改良ADSCs，来探究被GDF5修饰后的ADSCs是否能够促进其干细胞向软骨的分化及增殖。在培养3周后发现干预组(即被GDF5修饰的ADSCs)所产生的硫酸化糖胺聚糖(sulfated glycosaminoglycan，sGAG)高于对照组(即未被修饰的ADSCs)，且干预组ADSCs相比对照组，更易聚集形成细胞团，细胞团的形状也更加规则。这项研究表明被GDF5修饰的hADSCs更有利于向软骨分化。GDF5基因修饰的干细胞对于修复DDH中软骨发育不良方面具有巨大潜力，但仍需更多的研究去挖掘与支持，以用于临床患儿的治疗。

3 展望

DDH与患者的性别、家族遗传史及出生时体位等多种危险因素相关，且目前多种切开复位手术治疗方案存在远期危险并发症(如股骨头坏死等)，早期的发现与诊断仍然是阻止DDH进展的重点。早期的临床体格检查与动静态的超声检查是目前DDH主要的诊断方法，也是用于评判对患者采取何种手术方式及预后的指标。基因谱中GDF5基因分析可与超声检查结合，用于准确并及时对具有GDF5变异基因的患者实施早期评估和干预，从而避免DDH进一步的进展及医务人员进行的不恰当的过度治疗。这为医务人员实施个体化治疗与精准医疗提供了便利，也提高了患者的医疗获益，但具体在临床上的应用及普及仍有许多待解决的问题。

GDF5在骨骼和肌肉的发育过程中起着重要的作用，控制着软骨和骨的发育、修复与维持，并对髋部的形态发育具有调控作用[29]。位于GDF5基因的5′UTR SNP位点rs143383中T等位基因与DDH密切相关，TT型基因型的新生儿具有更高的患有DDH的风险[9]。但此项研究采集的标本所属人种较为单一，此结论是否适用于其他人种还有待证实与考核。另外，SNP位点rs143383的缺陷、GDF5基因的5′UTR的甲基化、CDMP-1基因与SOX基因表达的增强或减弱均可导致髋膝关节软骨的发育不良，进而引起DDH的发生。上述研究为研究人员深入了解DDH的发病机制拓宽了道路，但目前研究仍集中于基因分子层面，其下游相关信号通路激活的方式，体内是否存在影响GDF5基因、CDMP-1基因、SOX基因表达的其他基因，以及GDF5等基因在体内编码的蛋白水平的实际变化还知之甚少，因此GDF5基因在DDH发病机制上的作用仍有许多值得探究的空间。

此外，在小鼠关节内直接注射GDF5注射剂来改善软骨的发育，或采用GDF5修饰的干细胞以促进软骨细胞的增殖与分化等方案，为DDH的治疗提供了新的治疗策略。基于GDF5来制定DDH的治疗方案目前研究报道甚少，且上述多种策略仍处于细胞和小鼠的基础实验，其对于DDH的治疗疗效及临床可行性方面仍需要大量研究去探索和验证。但基于GDF5在促进软骨发育上的显著作用，其相关治疗策略在DDH治疗上具有巨大潜力。