丹酚酸B通过抑制NLRP3炎症小体priming阶段减轻缺氧诱导大鼠心肌细胞损伤

胡 洋，潘韵铮，李庆菊，郑仕中，卞 勇，时 乐，范方田，蒋宝平，许 立

(南京中医药大学 1.药学院，江苏 南京 210023， 2.翰林学院，江苏 泰州 225300)

丹参是心血管疾病最常使用的中药之一，丹酚酸B(Sal B)是其主要的水溶性成分[1]，具有广泛的生理活性，其可通过抗炎[2]、抗氧化、钙拮抗[3]、清除氧自由基等机制发挥心血管保护作用。心肌缺血作为心血管疾病的重要分型，在发生过程中往往伴随着剧烈的炎症反应。许多文献报道，抑制心肌缺血过程中的炎症反应能够有效减轻心肌缺血损伤[4]。TLR4/NF-κB信号通路与炎症反应的发生密切相关，已有研究表明，抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活可以减少多种促炎因子的分泌，缓解心肌缺血损伤[5-6]。IRAK1作为TLR4/NF-κB信号通路上的重要一环，抑制其磷酸化能够有效阻断TLR4/NF-κB信号通路的激活。

NLRP3炎症小体是固有免疫的组成成分之一[7]，在许多炎症性疾病的发生发展中扮演着中心角色。典型的NLRP3炎症小体激活需要priming阶段与激活阶段的共同参与。priming阶段刺激信号激活TLR4信号通路，然后促进核转录因子NF-κB激活，介导pro-IL-1β、pro-IL-18等炎症因子前体的产生，激活阶段刺激信号(如ROS、MSU、ATP等)可以促进NLRP3/ASC/pro-caspase-1蛋白复合物的组装，并活化caspase-1，之后活化的caspase-1将pro-IL-1β、pro-IL-18剪切活化为IL-1β和IL-18并释放到胞外，介导一系列的炎症反应[8]。本文旨在探究丹酚酸B能否通过调控NLRP3炎症小体激活的priming阶段，抑制NLRP3激活，从而达到减轻缺氧诱导的大鼠H9C2细胞损伤的目的。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂大鼠H9C2细胞株购于南京凯基生物技术股份有限公司；丹酚酸B(纯度≥98%)由南京虹桥医药技术研究所惠赠，批号：181218；胎牛血清购自BI公司，批号：1906287；CCK-8购自广州赛国生物科技有限公司，批号：EZ2811A179；白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)ELISA检测试剂盒购自于杭州联科生物技术股份有限公司，批号：2301B41114；心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)ELISA检测试剂盒购自于南京翼飞雪生物科技有限公司,批号：201903；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定试剂盒购自于上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0017；TLR4、Myd88、NF-κB、NLRP3、GAPDH引物合成于上海生工生物工程股份有限公司；TLR4(批号：00048459)、Myd88(批号：00056889)、IRAK1(批号：00022045)、NF-κB(批号：00057776)抗体购自于武汉三鹰生物技术有限公司；NLRP3抗体(批号：AB214185)购自于艾博抗生物公司；羊抗兔二抗(批号：10249)、凝胶试剂盒(批号：NO.072319190723)、0.25%EDTA-胰酶购自于上海碧云天生物技术有限公司；逆转录试剂盒(批号：2L8448)、SYBR荧光染料(批号：IL8353)购于镇江爱必梦生物科技有限公司；不完全高糖/低糖培养基(批号：20190702)购自于江苏凯基生物技术股份有限公司；PBS缓冲液购于武汉博士德生物公司(批号：BC20190620)购自于江苏凯基生物技术股份有限公司；IRAK1抑制剂(批号：05370)购自于MedChemExpress公司，；厌氧产气袋、缺氧盒以及氧气指示剂购自于日本三菱公司。

1.2 仪器Synergy2多功能酶标仪(美国Bioteck公司) ; Allegra 64R型超速冷冻离心机(美国Beckman公司) ; Bio-Rad电泳仪及凝胶成像仪(美国伯乐公司)；7500型定量PCR仪(美国ABI公司)，荧光倒置显微镜(德国ZEISS公司)。

1.3 方法

1.3.1大鼠H9C2心肌细胞培养以及药物配制 将H9C2细胞正常培养在含有10%FBS的DMEM不完全培养基中，放置于普通培养箱中常规培养(37 ℃、5% CO2、95%空气)，观察细胞形态。将Sal B溶解在无菌PBS溶液中，配置成5 mmol·L-1母液，放置于-20 ℃冰箱待用，根据实验需要，再将其用完全培养基稀释至各浓度。使用完全培养基将IRAK1抑制剂依照说明稀释为50 μmol·L-1备用。

1.3.2CCK8法测定不同浓度Sal B对H9C2细胞状态的影响 H9C2细胞生长至大约80%左右消化，然后以104个/mL浓度种于96孔板中，待细胞贴壁后，吸弃培养液，PBS洗涤2遍，每孔加入不同浓度Sal B (1 、5、10 、15 、20、25、30、35 μmol·L-1)继续培养48 h，然后每孔加入10 μL CCK8溶液孵育1 h，之后450 nm处测定OD值，实验重复3次。

1.3.3实验分组以及模型构建 实验分组为：对照组：正常生长的细胞；模型组：缺氧处理的细胞；实验处理组：使用1、5、25 μmol·L-1Sal B预处理24 h后缺氧造模的细胞；IRAK1抑制剂组：使用IRAK1抑制剂预处理2 h后缺氧造模的细胞。缺氧模型构建：待H9C2细胞汇合度达到约80%时消化，然后以4×105个/mL浓度于6孔板中培养，待细胞贴壁后加入不同浓度的Sal B培养24 h或IRAK1抑制剂培养2 h，之后改用不含血清的DMEM低糖培养基，置于安宁包所致缺氧体系中培养6 h，同时使用氧气指示剂，实时监测体系内氧气浓度。根据厂商说明，安宁包会快速吸收密闭容器中的O2，并维持约95% N2，5% CO2体系6 h[9-10]。

1.3.4CCK-8法检测细胞活力 H9C2细胞生长至大约80%左右使用胰酶消化，然后将细胞以104个/mL密度接种于2块96孔板中，随机将2块96孔板分为正常组和缺氧组。正常组细胞常规培养，缺氧组细胞分为缺氧模型组以及Sal B预处理组。缺氧组细胞使用不同浓度Sal B预处理24 h后缺氧造模6 h，之后加入CCK-8培养1 h，测450 nm处OD值，根据公式计算细胞活性，即：

H9C2细胞活性/%=(各实验组OD值-空白孔OD值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100%，实验重复3次。

1.3.5微孔板法检测LDH 将稀释后的细胞接种到6孔板中，设置模型组、对照组、Sal B预处理低、中、高剂量组，IRAK1抑制剂组，待细胞贴壁后Sal B预处理组换用不同浓度Sal B处理24 h；细胞贴壁后22 h抑制剂组换用IRAK1抑制剂培养2 h。在缺氧造模前将培养液更换为不加血清的DMEM低糖培养基，之后缺氧造模6 h，取各组上清，微孔板法测定LDH表达水平。

1.3.6ELISA检测cTn和IL-1β 将稀释后的细胞接种到6孔板中，设置模型组，对照组，Sal B预处理低，中，高剂量组，待细胞贴壁后Sal B预处理组换用不同浓度Sal B处理24 h；细胞贴壁后22 h抑制剂组换用IRAK1抑制剂培养2 h。在缺氧造模前将培养液更换为不加血清的DMEM低糖培养基，之后缺氧造模6 h，取各组上清，ELISA法测定cTn以及IL-1β表达水平。

1.3.7实时荧光定量PCR检测基因表达水平 实验分组以及细胞处理方法同上，缺氧造模后使用Trizol提取各实验组细胞RNA，并根据试剂盒使用说明将RNA逆转录为cDNA，-20 ℃保存待用。之后取各实验组cDNA进行实时荧光定量PCR测定，反应体系为EvaGreen 5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.3 μL，无核酶水3.4 μL。引物序列见Tab 1。

Tab 1 Primer sequences of selected genes

1.3.8Western blot检测蛋白表达 实验分组以及处理方法同上，之后提取各实验组细胞总蛋白，并用nanodrop测定各组蛋白浓度，然后将各组蛋白浓度稀释到同一水平，以每孔30 μg上样量跑胶。条件为：预电泳浓缩胶60 V电泳30 min，待Marker完全跑开后改用90 V继续电泳下层胶，充分分离后改用350 mA电流转PVDF膜1.5 h，之后PVDF膜用5%脱脂奶粉(1× TBST溶液配制)在室温条件下封闭1 h， 4 ℃孵育一抗过夜，隔天使用1× TBST溶液将PVDF膜洗涤3次，每次15 min，然后室温孵育二抗1 h，再把膜用1× TBST溶液洗涤3次，每次15 min。曝光显影，实验重复三次,用软件进行半定量分析。

1.3.9统计学分析 使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，多样本均数间比较采用单因素方差分析，两样本之间比较用t检验。

2 结果

2.1 不同浓度Sal B对H9C2细胞活力的影响如图所示，当Sal B浓度为30 μmol·L-1及以上时，与对照组相比，H9C2细胞存活率存在显著性差异。综合细胞存活率以及显微镜下细胞形态观察，本实验分别选用1、5、25 μmol·L-1作为Sal B预处理的低，中，高浓度。

Fig 1 Survival rate of H9C2 treated with different concentrations of Sal

*P<0.05,**P<0.01vsControl

2.2 Sal B对缺氧造模后H9C2细胞的影响如Fig 2所示，缺氧造模处理后，模型组H9C2细胞活力降低，高剂量Sal B预处理组H9C2细胞活性升高，且与模型组差异存在显著性。

Fig 2 Cell activity of each n=6)

##P<0.01vsControl;*P<0.05vsModel

2.3 Sal B降低缺氧造模后细胞上清中的LDH、cTn、IL-1β水平大量文献表明，在心肌缺血发生过程中LDH，cTn等心肌损伤标志物以及IL-1β等炎症因子的分泌量会增加。如Fig 3所示，与对照组相比，缺氧造模后，H9C2细胞LDH,cTn以及IL-1β分泌量升高。与模型组相比，中，高剂量组Sal B，IRAK1抑制剂预处理可以降低H9C2缺氧造模后的LDH分泌量，高剂量组Sal B，IRAK1抑制剂预处理可以降低H9C2缺氧造模后的cTn水平，提示Sal B对缺氧导致的H9C2心肌细胞损伤有一定的保护作用。且与模型组相比，高剂量组Sal B，IRAK1抑制剂预处理可以降低H9C2缺氧造模后的IL-1β分泌量，提示其作用机制可能与抑制心肌缺血过程中炎症因子的分泌有关。

2.4 Sal B降低缺氧造模后细胞TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3 mRNA表达水平如Fig 4所示，与对照组相比，缺氧造模组的TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3 mRNA表达水平明显升高；使用Sal B预处理后TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3 mRNA表达水平降低，与模型组差异有显著性。与模型组相比，IRAK1抑制剂组的TLR4、Myd88 mRNA表达水平差异未见显著性；IRAK1、NF-κB、NLRP3表达水平降低，且与Sal B预处理高剂量组比较差异未见显著性。

Fig 3 Effect of Sal B on levels of LDH,cTn and IL-1β in supernatant of H9C2 cells induced by

A：The expression level of LDH; B：The expression level of cTn; C：The expression level of IL-1 (1:Control; 2:Model;3: 1 μmol·L-1; 4:5 μmol·L-1; 5: 25 μmol·L-1; 6:IRAK1 inhibitor).##P<0.01vsControl;**P<0.01vsmodel group.

Fig 4 Effect of Sal B on relative mRNA levels in H9C2 cells induced by hypoxia(n=3)

A：mRNA expression levels of TLR4; B：mRNA expression levels of myd88; C：mRNA expression levels of IRAK1(1:Control; 2:Model;3: 1 μmol·L-1; 4:5 μmol·L-1; 5: 25 μmol·L-1; 6:IRAK1 inhibitor); D：mRNA expression levels of NF-κB(1:Control; 2:Model;3: 1 μmol·L-1; 4:5 μmol·L-1; 5: 25 μmol·L-1; 6:IRAK1 inhibitor); E：mRNA expression levels of NLRP3(1:Control; 2:Model;3: 1 μmol·L-1; 4:5 μmol·L-1; 5: 25 μmol·L-1; 6:IRAK1 inhibitor).#P<0.05,##P<0.01vsControl;**P<0.01vsModel.

2.5 Sal B降低缺氧造模后细胞TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3蛋白表达水平如Fig 5所示，缺氧造模处理后心肌细胞TLR4、Myd88、IRAK1、NF-κB、NLRP3蛋白表达水平升高；用Sal B预处理后蛋白表达水平降低。与模型组相比，IRAK1抑制剂组的TLR4、Myd88 蛋白表达水平差异显著性；IRAK1、NF-κB、NLRP3蛋白表达水平显著降低，且与Sal B预处理高剂量组比较差异未见显著性。

3 讨论

心肌缺血是一种血氧供需失衡的状态[11]。研究表明多种疾病都会导致心肌缺血的发生，如高血压、冠心病、动脉粥样硬化等。当机体受到外部环境或自身损伤因子等因素刺激时，TLR4/NF-κB信号通路首先被激活，并带来剧烈的炎症级联反应[12]。NLRP3炎症小体作为固有免疫的组成部分之一，在心肌缺血的炎症性损伤中扮演着重要的角色[13]。诸多研究显示，抑制心肌缺血过程中的NLRP3炎症小体的激活，能够有效减轻心肌缺血损伤[14]。

经典的NLRP3炎症小体激活需要启动阶段与激活阶段两个步骤，且在心肌细胞中必须两个阶段共同参与才能有效的诱导NLRP3炎症小体激活[15]。Priming阶段作为心肌细胞中NLRP3炎症小体激活的启动步骤，与心肌细胞中NLRP3炎症小体的激活密切相关。Sal B作为丹参中药理活性最强的水溶性成分之一，具有良好的抗炎活性。本实验结果表明，Sal B能够有效抑制缺氧诱导后心肌细胞中NLRP3炎症小体的priming阶段相关基因与蛋白表达，减少cTn等心肌损伤标志物和IL-1β等炎症因子的分泌，并减弱心肌细胞缺氧损伤，这为Sal B在临床上抗心肌缺血的应用提供了一定参考。但本实验仅在体外进行了验证，未能对相关信号通路进行更加充分的研究，后续将加入动物实验，更加明确Sal B抑制NLRP3炎症小体激活的机制。

Fig 5 Sal B inhibited protein expression of NLRP3 priming after hypoxia(n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Control

总之，Sal B能够有效抑制缺氧诱导的H9C2心肌细胞损伤，其作用机制可能与抑制NLRP3炎症小体priming阶段的激活有关。