褪黑素受体激动剂Neu-p11改善T2DM大鼠的胰岛素抵抗作用研究

高迎春，岳 颖，周 珺，马慧萍，张汝学

(1.解放军联勤保障部队第940医院，全军高原环境损伤防治重点实验室/国家中医药管理局临床中药学重点学科，甘肃 兰州 730050；2. 兰州大学药学院，甘肃兰州 730000)

线粒体是一个具有动态特性的细胞器，是机体细胞最主要的能量代谢场所。在不同生理过程和机体环境刺激下，不断融合和分裂，二者协同进行，线粒体通过维持动态平衡来保证其功能正常[1]。研究表明，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)及胰岛素抵(insulin resistance，IR)时，线粒体发生数量减少，体积减小，线粒体呼吸功能减弱，DNA分布不均，ATP合成减少，线粒体生物合成下降等现象。充分说明线粒体平衡、线粒体功能障碍与T2DM有重要联系[2]。

正常组织细胞内腺苷酸激活蛋白激酶(AMP activated protein kinase， AMPK)磷酸化激活后，诱导沉默调节蛋白1(Sirt1)介导的过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，Coactivator-1α ，PGC-1α)通路，协同下游靶基因(estrogen related receptor α，ERRα)共同作用，调节线粒体融合蛋白(mitofusin2，Mfn2)，影响线粒体融合效率[3]。同时Sirt1/ PGC-1α通路，可启动核呼吸因子NRF-1/2，调控线粒体DNA表达，参与线粒体生物合成和氧化磷酸化过程，影响线粒体内ATP的合成及其酶活性。T2DM时，线粒体在不同组织中ATP合成减少，酶活性降低，高糖状态下机体细胞内AMPK活性抑制，表达减少，导致PGC-1α、NRF-1/2的表达减少，生物合成失调，线粒体呼吸作用破坏，Mfn2蛋白表达降低，线粒体融合降低，动态平衡失衡，线粒体功能降低，从而致使细胞对胰岛素的敏感性减弱[4-5]。

褪黑素是一种可循环性激素，主要在松果体中合成分泌，也存在于其他组织内。它对线粒体功能的维持及机体葡萄糖稳态的维持、T2DM导致的IR等都具有调节作用。另有一些实验结果证实，褪黑素可以改善不同病因造成的不同组织如：大脑、肝脏，以及心脏和骨骼肌内的线粒体功能障碍和平衡失调，可通过影响信号传导、线粒体呼吸以及氧化应激等来达到改善病症的效果。同时证实，褪黑素不仅可以改善线粒体呼吸功能和减轻氧化应激，还可以直接抑制线粒体渗透性过渡孔(mPTP)，涉及到信号传导凋亡与坏死细胞清理。Neu-p11，新型褪黑素受体激动剂，相较褪黑素具有半衰期更长，选择性更高，不良反应小，易合成的优势。

本实验采用高脂膳食喂养，加小剂量STZ诱导建立T2DM大鼠模型，着重研究T2DM状态下，肝脏线粒体平衡的动态变化，功能异常及能量代谢变化。以线粒体融合分裂的动态变化与线粒体功能的关系为基础视角，探究褪黑素受体激动剂Neu-p11不同给药剂量是否能以调节T2DM大鼠肝脏线粒体平衡相关因子，维持线粒体动态平衡为机制，改善其胰岛素抵抗的作用。

1 实验材料和方法

1.1 实验动物SPF级雌性Wistar大鼠60只，体质量(160～180)g，由兰州大学提供，动物合格证号：No 62000800000144，许可证号：SCXK(甘)2013-0002。饲养于兰州总医院动物实验科，定量摄食进水，室温(18～25) ℃。

1.2 主要药品与试剂柠檬酸(20100304，天津市大茂化学试剂厂)；柠檬酸三钠(20090826，莱阳市双双化工有限公司)；胰岛素放射免疫分析药盒(S10950186，天津九鼎医学生物工程有限公司)；Primescript RT Master Mix ，TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit ，TaKaRa SYBR Premix Ex Taq(RR036A，9767，RR802A，TakaRa公司)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，ELC超敏发光液，10×TBST，SDS(sodium dodecyl sulfate)，TRIS，甘氨酸，4×蛋白质上样缓冲液(含β-巯基乙醇)，脱脂奶粉(20170506，20170629，909C0518北京索莱宝科技有限公司)；小鼠抗β-actin单抗，山羊抗小鼠抗体/辣根酶标记，山羊抗兔抗体/辣根酶标记(中山金桥)；小鼠单克隆抗体DRP1，兔多克隆抗体PGC1 alpha，兔单克隆抗体Mitofusin2(abcam)RIPA裂解液(强)，100 mmol·L-1PMSF(S7506，碧云天生物技术研究所)；0.45 μm PVDF膜(K5PK92821，Immobilon-P®Transfer Membranes)高脂饲料(自备，基础饲料40%、鸡蛋34%、猪油20%、白砂糖 5.1%、热量为22.1 kJ·g-1、糖类热量25%、脂肪热量60.17%，兰州军区兰州总医院动物实验科)。

1.3 实验仪器BP210S电子天平，赛多利斯有限公司公司；PHS-3B型 PH计，雷磁仪器公司；HP-8453 紫外分光光度计，美国惠普公司；SpectraMax i3 全自动荧光酶标仪，美国 Molecular公司；Sigma 3K15低温离心机，德国 Sigma公司；IEC- Micromax离心机，美国ThermoElectron公司；MG96G Long Gene PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司；AB ViiA7 Realtime PCR，美国Applied Biosystems公司。Powerpac TM Basic 基础电泳仪电源和小型垂直电泳槽，Trans-Blot®TurboTMTransfer system半干转仪BIO-RAD 公司；UVP型全自动数码凝胶图像分析系统，美国BioImaging Systems公司。

2 实验方法

2.1 T2DM大鼠模型的建立、分组及给药雌性Wistar大鼠60只在实验环境中适应10 d后，随机抽取10只作为正常对照组，剩余50只作为造模组。正常对照组给予常规饲料饲养，造模大鼠均给予高脂饲料饲养，期间自由饮水。两个月后，造模大鼠空腹16小时后，按体质量腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)，7天后测定空腹血糖，根据大鼠血糖状态未达标者再次注射STZ(15 mg·kg-1)，7天后测定空腹血糖，将血糖值>13.0 mmol·L-1的大鼠为造模成功，按照血糖和体质量均分为糖尿病模型组、阳性药组、褪黑素受体激动剂Neu-p11低、高剂量组，每组10只。每天8:30 am给药。正常对照组与模型组给等量水，阳性药组给予10 mg·kg-1褪黑素，给药低、高剂量组分别给予5 mg·kg-1、10 mg·kg-1褪黑素受体激动剂Neu-p11；灌胃体积为1 ml·200 g-1，连续给药4 w。

2.2 胰岛素(INS)含量的测定及胰岛素抵抗指数(HOME-IR)、胰岛素敏感指数(ISI)的计算血清INS含量采用放免法测定，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。HOME-IR=FBG(mmol·L-1)×INS(m IU·L-1)/22.5

ISI=Ln 1/[FBG(mmol·L-1)×INS(m IU·L-1)]

2.3 RT-PCR法测定大鼠肝脏组织相关基因的表达大鼠处死后，剖取大鼠肝脏组织，称取约20 mg，加Buffer RL试剂600 ml研磨匀浆，提取肝脏组织中的总RNA。将提取的总RNA反转录为cDNA，反应条件：37 ℃ 15 min；85 ℃，5 s；-20 ℃保存。根据AMPK、ERRα、Sirt1、Nrf1和Nrf2基因序列设计引物(如Tab 1)。RT-PCR：反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，31 s；40 个循环；-20 ℃保存。每批模板均同时进行内参β-actin 和目的基因的扩增反应。

Tab 1 primer sequence

2.4 Western blot测定大鼠肝脏组织相关蛋白的表达取肝脏组织50 mg，加入RIPA强效裂解液(含1% PMSF)制成约10%的匀浆液，冰上静置30 min后，放置于4 ℃高速冷冻离心机，转速12 000 rpm离心5 min，分离上清液至新的EP管中。取部分上清稀释20到40倍后，BCA法测定蛋白浓度。再用RIPA强效裂解液将上清液蛋白浓度稀释至10 μg·μL-1，以1 ∶3的比例吸取4×loading buffer与稀释后的上清液混合，振荡器混匀，再置于100 ℃的沸水水浴锅中，加热变性5 min，冷却至室温后，12 000 rpm离心5 min，转移上清液至新的EP管中，分装上清后，-80 ℃保存。每孔上样60 μg总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳后半干转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，β-actin一抗(1 ∶1 000)，目的蛋白一抗(1 ∶500)，室温摇床孵育2 h，4 ℃过夜，TBST洗涤PVDF膜8 min×5，二抗(1 ∶1 000)室温摇床孵育2 h，TBST洗涤PVDF膜8 min×5，滴加ECL，Tanon-4200SF全自动数码凝胶图像分析系统曝光。曝光图片的灰度扫描测定应用Image-Pro Plus6.0软件进行。

3 实验结果

3.1 大鼠胰岛素(INS)水平与正常组相比，T2DM大鼠胰岛素水平和HOMA-IR均有较大上升，而胰岛素的敏感性降低；相较模型组，低剂量对胰岛素抵抗有所缓解，但给药组对于2型糖尿大鼠的胰岛素敏感程度的改善效果微弱。(如Tab 2)

3.2 肝脏线粒体相关因子mRNA的表达相比较正常组，T2DM大鼠肝脏的AMPK、ERRα、Sirt1、Nrf1和Nrf2 mRNA的表达均呈现异常，其中模型组的ERRα mRNA呈现表达过量(P<0.01)，AMPK、Sirt1、Nrf1和Nrf2 mRNA表达显著降低(P<0.01)；相较模型组，褪黑素和Neu-p11低剂量组对ERRα基因表达过量的趋势有所缓解(P<0.01)，给药组对AMPK、Sirt1、Nrf1和Nrf2 mRNA的基因表达有增加作用，其中低剂量最优(P<0.05)。(如Tab 3，Fig 1)

3.3 ATP含量及其酶活力相比较正常组，T2DM大鼠肝脏的ATP含量显著降低，其中模型组的ATP含量降低最为明显(P<0.01)。相较模型组，给药组对ATP的合成有所改善，Neu-p11低剂量组对其改善最为显著(P<0.01)。(如Tab 4)

Tab 2 Effect of Neu-p11 on INS levels in T2DM rats(μ

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

Tab 3 Effect of Neu-p11 on liver mitochondrial balance-related factor gene expression in T2DM

*P<0.05,**P<0.01vsControl;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 4 Effect of Neu-p11 on liver ATP content and ATPase activity in T2DM rats

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 1 Effect of Neu-p11 on expression of AMPK and ERRα mRNA in liver of T2DM rats

Control: normal control group; Model: model group; MLT: melatonin group; Neu-L: Neu-p11 low dose group;Neu-H: Neu-p11 high dose group.**P<0.01,vscontrol;#P<0.05,##P<0.01,vsmodel.

3.4 PGC-1α、Mfn2蛋白的相对表达与正常组相比，T2DM大鼠肝脏的PGC-1α表达显著升高，其中模型组的PGC-1α表达增加最为明显(P<0.01)。相较模型组，给药组对PGC-1α过度表达有所改善，Neu-p11高剂量组对其改善最为显著(P<0.01)。

相比较正常组，T2DM模型组大鼠肝脏Mfn2蛋白表达显著升高(P<0.01)。相较模型组，褪黑素组和Neu-p11低组对Mfn2过度表达有所改善，其中褪黑素组和Neu-p11低剂量组对其改善最为显著(P<0.01)。

4 讨论

T2DM以IR为基础的发病机制，以胰岛素对肝脏、肌肉等周围组织的主要摄取和葡萄糖利用能力降低为主要表现。IR的主要特点是代谢紊乱，T2DM状态时，机体内糖脂代谢紊乱，肝脏、肌肉等主要器官，胰岛素的敏感性降低，胰岛素作用能力减弱，对糖的利用和代谢降低，造成能量物质堆积，形成IR的发展和加剧[6]。而线粒体功能与IR有重要联系，线粒体是机体细胞内最重要的能量代谢场所，由线粒体内氧化磷酸化为主要途径合成的ATP参与机体内葡萄糖代谢，脂类代谢及多种代谢途径，因此线粒体功能障碍则会导致肝脏中ATP合成减少，机体代谢紊乱，形成IR。而线粒体形态结构的动态平衡与功能调节有密切关系，维持线粒体基本形态和功能的根本就在于维持线粒体融合和分裂的动态平衡[7-8]。

研究发现，线粒体融合依赖其主要蛋白之一为线粒体融合蛋白(Mfn2)，作用过程复杂，受多个相关因子的共同调节。机体细胞内的过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α(PGC-1α)，它也是线粒体生物氧化的转录因子，它可协调下游靶基因雌激素相关受体α(ERRα)刺激线粒体Mfn2的表达，进而促进线粒体融合，同时也促进线粒体能量代谢[9]。T2DM和IR时，Mfn2、PGC-1α表达降低，Mfn2与IR呈现相关性，Mfn2表达低下更容易造成IR的发生[10]。本实验结果显示，T2DM大鼠肝脏内Mfn2和PGC-1α的蛋白表达上升，ERRα的mRNA表达异常增加，给予低剂量Neu-p11后，Mfn2、PGC-1α的蛋白及ERRαmRNA的表达异常明显改善。

腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)作为PGC-1α上游重要的激活因子，同样参与线粒体平衡的动态调节，它作为重要的能量调节器，其活性直接影响了组织细胞内AMP/ATP的比值，由此影响PGC-1α的表达，参与机体内的能量代谢活动[11]。同时沉默蛋白调节因子(Sirt1)通过去乙酰化作用，激活PGC-1α促进线粒体的生物合成，它在调节细胞的增殖、分化、衰老、凋亡和代谢等方面发挥了重要作用。Sirt1/PGC-1α通路，可启动核呼吸因子NRF-1/2，调控线粒体DNA表达，参与线粒体生物合成和氧化磷酸化过程，影响线粒体的正常功能，影响线粒体内ATP的合成及其酶活性[12]。IR发生时，AMPK、Sirt1表达降低，NRF-1/2表达减少，影响线粒体呼吸作用，进而造成PGC-1α在机体内表达降低，机体ATP合成减少，代谢失衡。本实验T2DM大鼠肝脏AMPK、Sirt1、Nrf-1/2 mRNA表达和ATP含量显著降低，IR显著，胰岛素敏感性降低。给予药物治疗后， AMPK、Sirt1、Nrf-1/2 mRNAmRNA表达增加，ATP含量提升，ATP酶活力增加，IR改善明显。

总而言之， Neu-p11通过改善T2DM大鼠肝脏内PGC-1α、Mfn2的表达降低和相关因子ERRα、AMPK、Sirt1、NRF-1/2 mRNA的表达异常，增加肝脏ATP的含量，参与机体代谢，改善IR。线粒体功能的正常调节与其数量、形态和分布不可分割，这都需要通过维持线粒体融合与分裂的动态平衡来实现。介入并干预T2DM与IR时线粒体融合与分裂，可能影响线粒体功能，影响其内部的氧化磷酸化生成ATP，参与机体代谢而改善IR，可能是机体改善IR 和T2DM 的途径之一。