木霉菌辅助合成纳米银对甜瓜的防病促生作用研究

曲明星，姚薇，高增贵，夏润玺，刘限*

1. 沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866；2. 沈阳农业大学植物保护学院，辽宁 沈阳 110866

甜瓜（Cucumis melo）枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的一种重要土传病害，全国各地都有发生（衣杰，2006），严重影响甜瓜品质和产量，严重时造成甜瓜绝产（王志丹，2014）。近年来，枯萎病的发生越来越严重，防治也更加困难（李兴龙等，2015）。化学农药的使用，容易造成甜瓜品质下降，环境污染，病原菌产生抗药性（陆楚月等，2015；吴丽媛等，2014；范星菊等，2018）。因此，人们在寻找化学农药的替代品，采用各种天然和人工控制方法来保护植物免受这些疾病的侵害（郭海艳等，2018；刘翔等，2010；庄敬华等，2005）。

纳米银（Silver Nanoparticles，AgNPs）作为抗微生物剂已引起人们的重视（Kaur et al.，2016）。AgNPs是指粒径在1—100 nm之间的超细银颗粒，具有独特的理化性质和强大的杀菌活性，为生物医学、农业、环境和生理化学研究开辟了新思路，逐渐得到了科学界的认可（Seetharaman et al.，2018；Arvizo et al.，2012）。目前，AgNPs作为杀菌剂已被应用于植物病原真菌的防治，如根腐离蠕孢（Bipolaris sorokiniana）、（Magnaporthe grisea）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）等（Jo et al.，2009；Mahdizadeh et al.，2015；Bhainsa et al.，2006）。AgNPs可通过物理、化学和生物方法获得，物理法制备 AgNPs操作复杂，所需仪器成本高；化学法制备过程简单快速，但化学试剂的毒副作用会对人或环境造成威胁。从细菌、真菌或植物等生物中提取的还原剂和稳定剂合成 AgNPs可用于抑制病原菌、消除植物病害且可有效降低化学方法的副作用（Prabhu et al.，2012）。真菌在参与合成AgNPs过程中由于可产生大量蛋白质，且易于处理和经济可行而备受关注。木霉菌作为传统的生防菌，代谢产物丰富，生长速度快，环境适应能力强，已有研究利用Trichoderma reesei（Gemishev et al.，2019）、T.hamatum（Abdel-Kareem et al.，2018）、T.asperellum、T.harzianum、T.virens、T.longibrachiatum和T.brevicompactum（Nandini et al.，2017）辅助合成金属纳米粒子。Elgorban et al.（2016）利用T.viride发酵液合成的AgNPs能够抑制鲍氏志贺氏菌（Shigella boydii）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、宋内志贺杆菌（Shigella sonnei）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的生长。Saravanakumar et al.（2018）利用T.atroviride（KNUP001）辅助合成的 AgNPs对大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生长具有抑制作用。本研究利用木霉菌合成 AgNPs来探究其对甜瓜种子萌发和对甜瓜枯萎病的防治作用，为开发甜瓜枯萎病防控的新型药剂和农作物枯萎病的防治奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 微生物和种子

木霉属真菌：T.atroviride（KJ634780.1），T.crassum（KP008865.1），T.longbranchunes（MK179408.1），T.spirale（FJ436184.1），T.virens（MK439945.1），T.afroharzianum（KR911897.1），T.koningiopsis（ LC317803.1），T.hamatum（KF294843.1），T.citrinoviride（KJ665451.1）和T.velutinum（JX500738.1），分离于柞树（Quercus）根部，保存于沈阳农业大学生物科学与技术学院蚕桑实验室。

尖孢镰刀菌：F.oxysporum分离于患枯萎病的甜瓜株体，来自沈阳农业大学植物保护学院。

甜瓜种子：甜瓜种子（红城5号）购买于苗壮农资公司。

1.1.2 培养基

PDA培养基：新鲜土豆200 g去皮切块于蒸馏水中煮沸20 min后8层纱布过滤，过滤好的土豆液重新倒入锅中，加入20 g葡萄糖，20 g琼脂条，不断搅拌直至琼脂条完全溶解，定容至1000 mL，分装灭菌，备用。

PDB培养基：新鲜土豆200 g去皮切块于蒸馏水中煮沸20 min后8层纱布过滤，过滤好的土豆液加入20 g葡萄糖，定容至1000 mL，分装灭菌，备用。

1.1.3 试剂

硝酸银（分析纯 AR）：西陇科学股份有限公司；次氯酸钠（化学纯CP）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AgNPs的生物合成

将木霉菌在PDA培养基上活化后，转入PDB培养基，置于摇床培养，转速150 r·min-1。在26 ℃下培养3 d后，使用无菌Whatman 1号滤纸过滤并收集发酵液。每100 mL发酵液加200 μL AgNO3（1 mol·L-1），静置光照条件下反应5 d。离心（10000 r·min-1，30 min）收集 AgNPs，无菌水洗涤两次，75%乙醇洗涤1次，自然晾干，称质量备用。

1.2.2 AgNPs对尖孢镰刀菌的抑菌试验

将 AgNPs颗粒溶于无菌水，配制成质量浓度为10000 mg·L-1的AgNPs溶液，使用超声波细胞破碎仪对AgNPs充分破碎后，加入到PDA培养基，使培养基中 AgNPs最终质量浓度分别为 0 mg·L-1（对照组，下同）、25、50、100和 200 mg·L-1。晾干培养基后接镰刀菌菌片，28 ℃倒置暗培养 7 d后，通过测量菌落直径调查镰刀菌生长情况。3次重复。

1.2.3 AgNPs的物理化学表征

使用UV-Vis（UV-Vis U-3010，日本）在300—800 nm波长范围对AgNPs进行全波长扫描。AgNPs以干燥粉末形式与KBr混合，压片后暴露于红外光下，在4000—500 cm-1波数范围内对其进行傅里叶变换红外光谱（FTIR，Nicolet nexus 410，美国）表征检测。在40 kV的电压和30 mA的电流下，以CuKα1为辐射源，2θ扫描范围30—85°，对产生的AgNPs进行X射线衍射分析晶体结构（XRD，XPert Pro MPD，荷兰）。将一滴AgNPs水溶液加到覆有碳膜的铜网上，室温干燥，使用透射电子显微镜TEM（TEM，HT 7700，日本）在100.0 kV下观察AgNPs形状和尺寸。

1.2.4 AgNPs对甜瓜种苗生长的影响

种子预处理：选取籽粒饱满、大小均匀的甜瓜种子，无菌水清洗3次，10%次氯酸钠浸泡30 min后用灭菌水清洗3次，于36 ℃培养箱中浸泡12 h后备用。

种子萌发：将用质量浓度为 0、25、50、100、200 mg·L-1的 AgNPs溶液浸湿的滤纸分别放于培养皿中，每皿放 20粒种子，置于26 ℃下暗培养，每隔2 d加2 mL无菌水。每天观察记录种子萌发情况，在第 10天记录根长、茎长、鲜质量和干质量（60 ℃烘干箱2 h）。根据公式计算发芽势（E）和发芽率（P）。

式中，G'为5 d内的发芽数；G为10 d内的发芽数；T为供试种子总数。

1.2.5 AgNPs对甜瓜枯萎病的防效

采用蘸根法接种尖孢镰刀菌，当瓜苗长约 10 cm时，将苗根部划伤后浸于浓度约为106cfu·mL-1的镰刀菌孢子悬液中，15 min后再转移至含有质量浓度为0、25、50、100、200 mg·L-1的 AgNPs水溶液培养皿中进行培养，3 d后观察并记录发病情况。每处理20株，3次重复。根据公式计算发病率和病情指数。

式中，M为发病率；D为病情指数；C为总发病数；C'为各级发病数；i为相应发病级数；I为最高级数；N为总株数。

枯萎病分5级标准。4级：主根大部变褐色及整株枯萎或枯死；3级：主根1/2以上变褐色；2级：主根变褐色或须根1/4—1/2变褐色；1级：须根1/4以下变褐色，地上无症状；0级：整株无病症。

1.3 数据处理

试验数据运用 Excel 2016进行初步整理、分析，运用SPSS 21.0进行One-way ANOVA方差分析，用Duncan法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 AgNPs对尖孢镰刀菌的抑制作用

木霉菌辅助合成的 AgNPs均对尖孢镰刀菌有抑制作用，在相同质量浓度下，不同木霉菌辅助合成的AgNPs对尖孢镰刀菌的抑制率不同，AgNPs-T.longbranchiatum的抑制率最好；AgNPs对病原菌抑制作用随质量浓度增高而增大，不同木霉菌合成的 AgNPs均在试验使用的最高质量浓度（200 mg·L-1）下显示最高抑制效果，其中 AgNPs-T.longbranchunes在质量浓度为200 mg·L-1时抑制率最高（48.996%，表1）。

2.2 AgNPs-T. longbranchunes表征分析

选取对尖孢镰刀菌具有高抑制活性的纳米银粒子AgNPs-T.longbranchunes进行表征分析。木霉菌发酵液与AgNO3生物合成AgNPs，在样品孵育72 h后，通过UV-Vis光谱分析（图1A），显示表面等离子体共振发生在 417 nm处。X射线衍射（XRD）分析（图1B）2θ角在30°—85°之间出现4个强的特征衍射峰，其中2θ值分别对应38°、44°、64°、77°和81°这5个衍射峰与卡（JCPDS文件号01-1167）中银的标准图谱十分吻合，分别对应着（111）、（200）、（220）、（311）和（222）5个晶面，表明 AgNPs结构为典型的面心立方结构。FTIR分析（图1C）结果显示在3752.91、3676.55、3447.52、2924.43、1627.41、1383.62、1022.59 和577.11 cm-1出现红外光谱吸收带，其中 3752.91 cm-1和3676.55 cm-1处为OH基团的反对称伸缩振动的肩峰，3447.52 cm-1处的宽带振动主要是OH伸缩振动峰和氨基酸中 NH伸缩振动的叠加，2924.43 cm-1处是有机酸类物质的羧酸OH的伸缩振动峰和亚甲基CH2不对称伸缩振动峰，1627.41 cm-1处是由共轭双键C=C苯环骨架振动引起的特征峰，1383.62 cm-1处是 CH3的弯曲振动峰，1022.59 cm-1处的CO键伸缩振动，是醇、酯基、醚基或酚类的CO基团振动峰，而577.11 cm-1与AgNPs有关。通过TEM（图1D）观察到AgNPs粒径范围为5—15 nm，且大多数是分散的。

表1 AgNPs对尖孢镰刀菌的抑制率Table 1 Inhibitory rate of silver nanoparticles against F. oxysporum

图1 AgNPs表征Fig. 1 Characterization of AgNPs

2.3 AgNPs-T. longbranchunes对甜瓜种苗生长的影响

AgNPs-T.longbranchunes对甜瓜种苗生长有明显的影响。AgNPs质量浓度在25 mg·L-1时发芽势、发芽率、根、茎、鲜质量和干质量均大于对照组。当AgNPs质量浓度大于25 mg·L-1时影响了甜瓜种子的萌发，根、茎和鲜质量均降低且与对照组有显著性差异，干质量差异不明显。由此说明，低质量浓度（25 mg·L-1）AgNPs能促进甜瓜种子萌发及生长（图2）。

2.4 AgNPs-T. longbranchunes对甜瓜枯萎病防效研究

接种镰刀菌后，使用不同浓度 AgNPs-T.longbranchunes处理甜瓜苗，调查甜瓜幼苗的发病情况。结果表明，AgNPs-T.longbranchunes能够降低甜瓜枯萎病的发病率和病情指数；AgNPs-T.longbranchunes浓度为25 mg·L-1时发病率为80%，感病指数为66.67，随AgNPs-T.longbranchunes浓度增大，发病指数随之降低，200 mg·L-1时发病率降低为 33.33%，感病指数为 23.27，说明高浓度AgNPs-T.longbranchunes能够有效缓解尖孢镰刀菌对甜瓜的致病性（表2）。

3 讨论

AgNPs由于具有低毒性、广谱抗菌性、持续性好和安全性高等特点，近年来作为抗菌剂已被广泛应用于植物病害管理上（Al Abboud，2018）。本研究以不同木霉菌合成的 AgNPs对甜瓜枯萎病病原菌进行了抑菌研究，结果表明不同木霉菌合成的AgNPs对病原菌抑制情况不同，AgNPs-T.longbranchunes对尖孢镰刀菌具有较高的抑制作用，可降低甜瓜枯萎病发病率和病情指数。AgNPs的抑菌活性受到不同颗粒特征，如尺寸、形状和封端剂的影响（Ahmed et al.，2016）；小粒径的AgNPs具有更好的杀菌活性（Kumari et al.，2017），具有丰富封端剂的AgNPs是生物合成AgNPs的抗菌活性优势（Basha et al.，2010）。通过分析AgNPs-T.longbranchunes的表征特性，可知获得了高度结晶的、具有稳定封端剂的、粒径尺寸较小且分散性好的AgNPs。

表2 不同浓度AgNPs-T. longbranchunes对甜瓜枯萎病发病和病情指数的影响Table 2 Effect of different concentrations of AgNPs-T. longbranchunes on the disease index of muskmelon wilt

图2 不同浓度AgNPs对甜瓜种子萌发及生长的影响Fig. 2 Effect of different concentrations of AgNPs on germination and growth of melon seeds

AgNPs-T.longbranchunes处理甜瓜种子，在质量浓度为25 mg·L-1时，可促进甜瓜种子萌发及生长，增大浓度后种子萌发和生长都受到一定影响。有文献报道，AgNPs可提高玉米（Zea mays）、西瓜（Citrullus lanatus）、西葫芦（Cucurbita pepo）（Almutairi et al.，2015）、日本黄瓜（Cucumis sativus）（Sotoodehnia et al.，2019）、向日葵（Helianthus annuus）、大豆（Glycine max）（Shelar et al.，2015）和狼尾草（Pennisetum glaucum）（Parveen et al.，2015）等种子的萌发率。也有研究发现各种纳米材料对 6种植物种子萌发的轻微影响（Lin et al.，2007）。TiO2、ZnO、Al2O3和CuO等纳米粒子对苜蓿（Medicago sativa）、番茄（Solanum lycopersicon）、黄瓜（Cucumis sativus）和萝卜（Raphanus sativus）种子萌发及生长具有双重作用，低浓度下可促进种子萌发及生长，高浓度则产生抑制效果（Ahmed et al.，2019），这些结果与本研究结果基本一致。金属纳米粒子对植物的影响取决于金属纳米粒子的种类、质量浓度和植物种类（Zuverza et al.，2017）。金属纳米粒子促进植物种子发芽和增加植物生物量可能与增加植物硝酸还原酶，增强对水和肥料的吸收和利用能力（Yang et al.，2006；Rezaizad et al.，2019）和增加氨同化作用和相关酶的数量，有利于氨迅速转化为有机氮有关（Salama，2012）。金属纳米粒子对植物产生负面作用可能是释放的金属离子超过了种子和幼苗吸收金属离子的阈值水平，对植物产生毒害作用，也可能是高浓度的金属纳米粒子阻碍了植物根部水运输（Nair et al.，2014；Rastogi et al.，2017）。整体上高浓度的金属纳米粒子可能以多种方式干扰植物的新陈代谢，如通过提供微量营养元素、基因的上下调节以及干扰氧化过程从而导致负面影响（Ahmed et al.，2019）。

4 结论

不同木霉菌辅助合成的 AgNPs对尖孢镰刀菌具有不同的抑制效果，AgNPs-T.longbranchunes-CL抑菌效果最强。对AgNPs-T.longbranchunes-CL表征分析表明合成了具有高度结晶、含有稳定封端剂，粒径较小且单分散性好的AgNPs。试验使用最低质量浓度的AgNPs（25 mg·L-1）可促进甜瓜种子萌发及生长，而高质量浓度（＞25 mg·L-1且＜200 mg·L-1）表现出抑制作用。AgNPs可降低甜瓜枯萎病的发病率及病情指数。