结核分枝杆菌抑制吞噬体-溶酶体形成机制研究进展

秦菱涔 杜先智

重庆医科大学附属第二医院呼吸内科400010

结核病是由结核分枝杆菌传播所引起的一种全球流行性疾病,是造成人类死亡的十大原因之一。该疾病每年造成140万人死亡,尽管目前有多种抗结核药物用于抗结核治疗,结核病依然对全球公共卫生造成极大威胁。结核病是一种以空气传播为主要传播途径的肺部疾病,亦有少数可传播到人体其他器官引起肺外结核。研究发现,结核菌通过阻断巨噬细胞的凋亡、促进细胞坏死、诱导细胞自噬以及避免凋亡等途径来避免机体产生免疫反应并诱发机体感染[1-3]。正常的吞噬过程可以概括为细胞外受体与病原体发生初始相互作用后,信号通路诱导肌动蛋白丝聚合,使细胞膜伸长形成伪足包围病原体。细菌等病原微生物一旦被巨噬细胞所吞噬,细胞膜就会闭合成为一种叫做初期吞噬体的结构,随后该结构与溶酶体融合成为晚期核内体或吞噬溶酶体。同时该结构中的数种溶酶体裂解酶在酸性环境下(最适pH值为4.5～5.0)降解病原体。结核分枝杆菌能通过以下几种机制阻止吞噬体成熟。

1 抑制吞噬体内的酸化

结核分枝杆菌通过胞吞作用或与CR3、FcγR等特异性受体结合的方式进入巨噬细胞中,并聚集在吞噬体内。巨噬细胞处于静息状态时,吞噬体未与溶酶体融合,吞噬体内呈弱酸性,pH值为6.2左右;当结核分枝杆菌进入巨噬细胞中将巨噬细胞激活后,含有结核分枝杆菌的吞噬体将会与溶酶体融合形成吞噬溶酶体,融合过程中溶酶体中的大量蛋白水解酶将被激活,这些被激活的蛋白水解酶分解细菌等大分子物质形成的终产物使得吞噬体酸化,其pH值甚至可低至4.5[4]。然而事实上结核分枝杆菌能在巨噬细胞中生存、繁殖,且生存的微环境pH值较高,这表明结核分枝杆菌可能抑制吞噬体的酸化[5]。

研究表明,巨噬细胞内结核分枝杆菌将LAM和脂多糖等成分分泌到吞噬体中,同时LAM、脂多糖被转运到囊泡内作为脂膜循环,吞噬体将会与胞内的某些囊泡发生融合。在融合过程中,吞噬体与来自囊泡的膜蛋白结合,吞噬体对与之结合的膜蛋白具有一定选择性,能选择性地抑制其与H+-ATP酶结合,导致吞噬体始终缺乏H+-ATP酶参与酸化作用。这样就使吞噬体酸化过程障碍,吞噬体始终处于一个较高的pH值,从而阻止了吞噬性溶酶体的形成[6]。同时结核分枝杆菌在巨噬细胞内生长时会产生并释放大量的氨,升高溶酶体内pH值同时抑制溶酶体内蛋白质的降解,干扰溶酶体内蛋白质的代谢减少酸性终产物形成,从而抑制了吞噬体-溶酶体的结合[7]。

2 结核分枝杆菌感染诱导的细胞因子微环境影响Rab家族分子表达

研究结果显示,结核分枝杆菌在真核细胞内通过膜融合调节Rab分子功能[8]。Rab家族分子是RAS蛋白超家族的成员,其通常具有GTPase折叠和低相对分子质量;它们位于细胞内膜中,与人体膜融合过程和囊泡运输功能相关[9]。Rab20依赖的膜转运通路通过增加膜流入吞噬体的数量,有助于将结核分枝杆菌维持在膜结合室中,减少具有胞质通路的吞噬体数量,从而清除病原菌[10]。Rab分子是吞噬体成熟的标志物,Rab5出现在吞噬体的早期,Rab9出现在吞噬体的晚期[11]。在正常条件下,Rab7的活性形式(aRab7)与位于吞噬体膜中的Rab7相互作用溶酶体蛋白结合。aRab7/Rab7相互作用溶酶体蛋白复合物促进与微管相关的吞噬体/动力蛋白-动力蛋白激活蛋白复合物之间的联系。因此,吞噬体沿向心方向移动,促进吞噬体小管延伸到晚期内吞区室并诱导吞噬体成熟过程[12]。活分枝杆菌释放出一种催化Rab7 GTP/GDP转换的因子,削弱Rab7与Rab7相互作用溶酶体蛋白相互作用的能力,从而阻碍感染的吞噬体与溶酶体融合[13]。同时研究表明Rab22a是晚期内体的主要调节因子,感染结核分枝杆菌的吞噬体积累Rab22a以阻止Rab7聚集,使吞噬体成熟延迟。

3 含色氨酸天冬氨酸的外壳蛋白 (tryptophan-aspartate containing coat protein,TACO)/coronin 1的潴留

保持细胞外信号与细胞质整合的一个重要分子是TACO,也称为p57、coronin 1或CORO1A[14-15]。TACO对于调节多种F-肌动蛋白依赖性细胞过程至关重要[16-17]。90%左右含有活细菌的吞噬体保留了TACO,但与死菌结合的巨噬细胞在吞噬作用后的前2小时内释放出TACO。因此,TACO在吞噬体膜上的长时间潴留可能是活细菌阻碍吞噬体成熟的原因。

在牛分枝杆菌卡介苗感染模型中发现,TACO潴留是对细菌吞噬产生的细胞内信号的反应,但是只有当细菌以团块形式吞噬而不是作为单一生物体时才能观察到TACO潴留。此外,TACO定位于吞噬体膜中的Toll样受体2型(Toll-like receptor-2,TLR-2),表明TACO潴留是细菌聚集体阻断TLR2依赖性抗微生物机制的结果[18]。

另一方面,TACO参与抑制吞噬体成熟并非直接作用:因TACO促进细胞内Ca2+流入增加,激活钙调磷酸酶(钙依赖的磷酸酶),后者直接阻止吞噬体-溶酶体融合[19]。

4 ESX-1系统的蛋白质阻断吞噬体-溶酶体融合

分枝杆菌属Ⅶ型分泌系统即ESAT-6分泌系统-1(ESX-1),由RD-1及周围区域基因编码,该系统释放的抗原有以下4种:具有高度免疫原性的CFP-10、ESAT-6以及MM1553和Mh3881c 2种新蛋白。研究证明,以上抗原在抑制吞噬体成熟的过程中是不可或缺的。其中CFP-10、ESAT-6和Mh3881c以抗原依赖的方式分泌,特别是Mh3881c抗原,在其羧基末端断裂后,会导致吞噬体成熟停滞。而缺乏该系统的分枝杆菌在感染24、72 h后抑制吞噬体-溶酶体融合的效率较低,在巨噬细胞内存活的效率也较低。

ESX-1的吞噬体干扰作用为结核分枝杆菌的胞外DNA等物质提供了细胞质通路,细胞外DNA作为一种特异性激活配体,直接识别结核分枝杆菌DNA并激活STING的胞质DNA传感器环状GMP-AMP合成酶[20],作用于STING-TBK1-IRF3信号轴,诱导Ⅰ型干扰素产生[21]。有趣的是,缺乏IRF3的小鼠对长期结核分枝杆菌感染具有耐药性[22]。实验室发现,吞噬体破坏将导致结核分枝杆菌DNA的胞质定位触发了负责发病机制的STING-TBK1-IRF3-Ⅰ型干扰素通路[23]。综上,ESX-1系统能通过胞质结核分枝杆菌DNA诱导Ⅰ型干扰素产生破坏吞噬体而阻断吞噬体-溶酶体融合。

5 自噬参与延迟吞噬体成熟

自噬是细胞器和细胞溶质分子在自噬体囊泡内被识别和降解的过程。自噬和吞噬作用具有共同的特征,研究表明自噬可能调节吞噬作用[24]。在自噬中,吞噬细胞的双膜结构将细胞质中大分子成分包围,演变成一个自噬体,与溶酶体融合形成自噬溶酶体[12]。这个过程涉及与自噬有关的家族蛋白 (Atg)[25],它以复杂的交互级联和多种功能运作。自噬包括参与囊泡形成的4种蛋白质:Atg13、FIP2000、Atg101和Atg1/ULK1复合物 (ULK1/2)。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白非依赖性途径和活化蛋白激酶靶点等途径调控自噬的起始。Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶Vps34、p150、Atg14和Beclin 1等组成的空泡蛋白分选复合体影响吞噬体的形成。吞噬体膜的延长首先需要Atg12与Atg5结合,并与Atg16L形成复合物[26]。然后与微管相连接的LC3分裂,产生胞质LC3-i(Atg8),通过与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-ii,导致LC3-ii附着在隔离膜上[27]。关闭隔离膜使得自噬体形成过程得以完成,隔离膜与溶酶体融合形成自溶酶体并加工和消化细胞内病原体。

结核分枝杆菌可能通过阻止自噬体发展为自噬溶酶体或抑制其在自噬体内的降解等机制逃避自噬过程。磷脂酰肌醇3-激酶依赖性结合PI3P,PI3P参与自噬体成熟。因此,结核分枝杆菌的糖基化磷脂酰肌醇充当了细胞内运输途径的抑制剂,这对结核分枝杆菌抑制自噬体成熟是不可或缺的。

另一方面,LC3相关吞噬作用 (LC3-associated phagocytosis,LAP)在对抗多种细胞内病原体的感染中发挥重要作用。LAP包括传统受体和自噬受体,但作为自噬作用的触发因子的确切机制目前仍不清楚。TLR和c型凝集素等模式识别受体在启动细胞内信号传导中起关键作用,该信号传导导致吞噬体内LC3结合,诱导促炎细胞因子的合成。研究表明,结核分枝杆菌可以防止LAPosome融合,促进结核分枝杆菌的存活和增殖。

只有部分吞噬体与LC3有关[28]。研究表明,吞噬溶酶体囊泡中发现的beclin和LC3等分子在小鼠巨噬细胞吞噬体中的易位与双膜囊泡无关。该机制由识别受体如Fc、TLR、磷脂酰丝氨酸受体TIM4或β-葡聚糖Dectin-1受体启动;一旦发生受体识别,病原体就被吞噬并隔离在一个单膜吞噬体内,此时,在LAP下,磷脂酰肌醇-3-磷酸生成的Ⅲ类pi3-激酶复合物特异性结合到该单膜吞噬体腔室内,最后LC3-Ⅱ介导吞噬体与溶酶体快速融合[29]。

与传统的吞噬作用不同,在LC3介导的吞噬作用中,细胞类型和病原体将影响抗原表达。例如,在小鼠巨噬细胞中,抗原处理速度加快,而在人类细胞中,吞噬体的成熟似乎有所延迟[30]。有些微生物已具有完全避免吞噬体作用的功能,在这些区室内或在宿主细胞胞质内繁殖。

综上所述,结核分枝杆菌是一种细胞内病原体,它具有多种机制来逃避宿主的免疫反应。抑制吞噬体成熟、阻止吞噬体溶酶体形成作为机制之一将直接影响抗原加工和呈递,导致其他细胞群的无效激活,从而使结核分枝杆菌在巨噬细胞内生存、繁殖。尽管在该领域已有相关研究,但这种机制的确切性质仍然是难以捉摸的,需要进一步研究其阻止吞噬体成熟的分子机制。同时抑制吞噬体溶酶体形成并非结核分枝杆菌存活、增殖、致病的唯一机制,除此之外,还有降低抗原呈递分子的表达、通过坏死促进细胞死亡、防止细胞凋亡等机制。因此,进一步探讨吞噬体成熟和吞噬体-溶酶体融合的机制对于在早期阶段更好地控制疾病至关重要,为开发新的诊断方法和治疗提供了新思路。

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