关节液来源间充质干细胞在组织工程中应用研究进展

黄勇 陈斐 杨远 刘雨微 苏帆 傅子财 谢都 陈康 冯文哲 邓桢翰 陆伟 朱伟民

关节软骨损伤是临床常见疾病，损伤后通常难以自行愈合，患者常出现关节疼痛、水肿及功能受限[1]，并可发生慢性退行性病变。近年，软骨组织工程如自体软骨细胞移植、基质诱导的自体软骨细胞移植等成为软骨损伤的重要治疗方法[2]。选择理想的种子细胞是软骨组织工程的研究热点之一。

2004年，Jones等[3]首次报道在骨关节炎(OA)患者关节液中发现关节液来源的间充质干细胞(SF-MSC)，并证实其具有很强的成软骨能力。此外，有学者从踝关节及颞下颌关节的关节液中也分离得到SF-MSC[4-5]。SF-MSC通过关节液易于获取，其具有分化为软骨组织、脂肪组织及骨组织的潜能[6]。在关节韧带损伤、软骨损伤、早期OA患者的关节液中，SF-MSC数量显著增加[7-9]。与其他组织来源的间充质干细胞(MSC)相比，SF-MSC可从关节液中获得，提取方式创伤更小而其成软骨分化能力更强，因而成为更具应用前景的组织工程种子细胞。大量研究已使用SF-MSC作为种子细胞应用于软骨损伤治疗，并取得良好效果[6,10-11]。

1 SF-MSC来源与生物学特性

分离SF-MSC首先需获取关节液。关节液较多时可直接使用注射器抽取；关节液较少时，可先注入生理盐水，活动关节后抽出灌洗液。此外，也可以在关节镜手术中收集关节冲洗液[6,8]。将收集的关节液过滤除去杂质，梯度离心后弃去上清液，然后以培养基重悬细胞沉淀，接种于细胞培养皿中。由于SF-MSC具有贴壁生长的特性，通常在培养4 h后细胞贴壁，弃去上清液即可分离得到SF-MSC。一些学者采用不同方法获得SF-MSC，如通过磁激活细胞分选法分离纯化表达CD90的SF-MSC[12]；采用有限稀释法进行细胞克隆化培养，纯化SF-MSC[13]。

国际细胞治疗学会(ISCT)制定的MSC鉴定标准包括：①在标准培养条件下可贴壁生长；②表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、人白细胞抗原-DR；③具备成脂分化、成骨分化、成软骨分化能力[14]。根据该标准，已有较多学者从人及兔、马、猪等动物的关节液中成功分离SF-MSC[6,11,15-16]。此外，有学者还检测到CD44、CD49c、CD49f、CD151、CD140、CD146等细胞表面分子的表达，高表达这些细胞分子的干细胞更易成软骨分化[17-18]。干细胞有自我更新能力，可表达多能性相关基因Nanog、Oct4、Sox2[19]。Jia等[20]通过单细胞转录测序分析发现，SF-MSC与脐带间充质干细胞在某些基因表达上存在明显差异，这可能与它们在多向分化能力、免疫调节特性和组织修复能力等细胞生物学特性上存在差异相关。Mazzotti等[21]研究发现，不同年龄马的SF-MSC的成软骨分化能力、增殖能力以及细胞超微结构有明显变化，提示在研究时应充分考虑年龄对于SF-MSC生物学性能的影响。

Schofield[22]将MSC所处环境称为“niche”，其作用包括维持MSC的内稳态、增殖能力和细胞数量。由此可见，微环境对维持MSC生物学特性起着重要作用。

2 SF-MSC成软骨分化潜能

成软骨分化能力是MSC用于软骨修复的重要指标之一，决定着其软骨修复能力。有学者将自OA和风湿性关节炎患者中分离的SF-MSC进行成骨、成脂、成软骨分化的研究，发现与骨髓间充质干细胞(BMSC)相比，SF-MSC的成软骨分化能力较强，而成骨分化能力较弱[3]。在随后的研究中，他们将牛来源的SF-MSC与BMSC进行比较，结果显示SF-MSC的成软骨能力更强，再次证实SF-MSC较BMSC更适合用于组织工程[23]。研究发现，SF-MSC高表达CD44，而CD44是透明质酸受体，具有促进成软骨分化的能力[17,24]。通过检测特定的细胞表面分子，能够筛选出具有更强软骨分化能力的干细胞[12]。

有研究认为，与非关节组织来源的MSC相比，滑膜间充质干细胞(Syn-MSC)、SF-MSC等关节组织来源的MSC成软骨分化能力更优[25]。近期研究发现，SF-MSC的成软骨分化能力和关节软骨再生能力与Syn-MSC相当，在小鼠膝关节软骨缺损模型中分别移植SF-MSC与Syn-MSC，两者均有很好的软骨修复作用，而SF-MSC更易获取，因而被认为是组织工程更适合的种子细胞[26]。

Bertram等[27]研究发现，与正常关节来源的SF-MSC相比，来自OA患者病变关节的SF-MSC成软骨分化能力明显降低，认为这可能由于这些病变关节处关节液渗透压降低所致。同样，Krawetz等[28]的研究发现，与来自OA病变关节的SF-MSC相比，正常关节来源的SF-MSC更容易成软骨分化。OA是多因素引起的关节病变，因此OA病变关节来源SF-MSC的表型也受多种因素影响。Bertram等[29]研究发现，OA病变关节与正常关节的关节液中离子浓度存在明显差异，离子通道蛋白表达也有明显改变，这些成为影响SF-MSC功能的因素之一。

Ando等[30]通过比较同一供体来源的SF-MSC、Syn-MSC、BMSC、皮肤间充质干细胞的成软骨能力发现，SF-MSC与Syn-MSC的成软骨能力相似，但较BMSC或皮肤间充质干细胞的成软骨能力更强。Zayed等[15]对健康马进行研究，比较SF-MSC与BMSC的增殖能力、细胞表面分子表达和成软骨能力,发现经成软骨诱导，SF-MSC较BMSC表达更多的黏多糖，有更强的成软骨能力。

成软骨分化过程需通过多种信号转导通路精细调控，易受多种因素影响。对成软骨分化机制的研究能更好地理解不同来源MSC的生物学差异。

3 SF-MSC在组织工程中的应用

目前，学者们已在猪、鼠、兔等软骨缺损动物模型中开展实验研究，验证SF-MSC对软骨修复的有效性，造模时主要通过特殊钻头在股骨髁间的非负重区域去除一定直径的全层软骨[31]。SF-MSC需先在体外扩增，经表型鉴定和分化潜能鉴定后移植入体内。移植方法主要为注射法与复合支架材料移植法，软骨修复效果的评估主要通过国际软骨修复协会(ICRS)评分和Ⅱ型胶原成分组织学鉴定。

生物支架材料是组织工程中细胞移植的载体之一，可为细胞提供三维立体的生长分化环境，有利于修复缺损的组织结构。Chiang等[16]采用猪SF-MSC混合富血小板血浆(PRP)和温敏水凝胶修复猪股骨软骨损伤，修复后第4周和第8周进行组织学分析，结果显示SF-MSC联合PRP和温敏水凝胶可促进软骨细胞的再生和成熟。Zayed等[32]将复合马SF-MSC或BMSC的中性琼脂糖支架移植至鼠股骨滑车软骨缺损处进行软骨修复，12周后形态学和组织学检查结果显示，MSC与中性琼脂糖支架复合对软骨修复效果更优，并且修复的软骨组织中Ⅱ型胶原含量更高，提示为透明样软骨修复。该实验证实SF-MSC具有促进软骨修复的能力。同样，Li等[6]从关节镜冲洗液中分离SF-MSC，将其与水凝胶结合，移植到鼠股骨滑车全层软骨缺损模型中进行软骨修复，8周后将鼠处死，取股骨修复处的软骨组织进行组织学分析，结果显示软骨修复平整，免疫组化染色可见Ⅱ型胶原表达，形成透明软骨修复。

注射法为新的MSC移植方法，许多研究以此方式治疗OA已经取得良好效果，关节内MSC注射治疗简便安全。Jia等[33]的研究先在体外扩增SF-MSC，然后将其注射于兔膝关节软骨损伤模型，每周1次，共4次，在第8周和第12周切取再生软骨进行组织学分析，观察到缺损软骨完全再生修复。另一项研究中他们将SF-MSC与壳聚糖水凝胶混合，注射至软骨缺损部位，12周后发现兔软骨得到完全透明样软骨修复[11]。有学者通过切断裸鼠前交叉韧带制造OA模型，然后在关节内注射人SF-MSC进行软骨修复，结果显示与对照组相比，实验组并没有明显的软骨修复，认为关节内注射SF-MSC并不能修复OA的损伤软骨[10]。

目前研究表明，SF-MSC可有效修复软骨损伤，是理想的种子细胞来源。部分研究通过移植异种SF-MSC进行软骨修复，未发现移植造成的不良事件，表明异种来源的SF-MSC同样可有效修复软骨缺损。

4 展望

尽管大量文献报道SF-MSC是软骨缺损修复和治疗OA的理想种子细胞，但仍有很多问题亟待解决。首先，如何获得足够数量具有治疗效果的SF-MSC。其次，SF-MSC修复软骨损伤的机制尚不明确。第三，尚缺乏SF-MSC应用于临床治疗的研究报道。

SF-MSC作为软骨组织工程中新出现的种子细胞，其应用有两大优势：第一，关节液容易获取，创伤小，在门诊即可完成关节液抽取；第二，SF-MSC成软骨分化能力强。基于以上优点，SF-MSC应用于软骨组织工程有更广阔的前景。