气道平滑肌表观遗传修饰对支气管哮喘的影响

朱莹然 辛晓峰

东部战区总医院干部呼吸科,南京210000

1942年Waddington首先提出表观遗传学概念,其主要是指在不改变DNA 序列的情况下,所有细胞减数分裂或有丝分裂在表型或基因表达上的可遗传性改变。表观遗传修饰决定了哪些基因组区域容易发生表达改变从而导致可能疾病倾向的生理状态[1]。近年来随着对表观遗传学研究的深入,人们发现其在许多疾病中发挥重要作用,其调控功能紊乱可导致基因表达谱发生改变。目前,大多数支气管哮喘(哮喘)患者气道平滑肌 (airway smooth muscle,ASM)细胞的表观遗传学研究集中在组蛋白修饰上,尤其是组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化[2]。近几年来,对于甲基化修饰对哮喘的调控作用以及非编码RNA 在哮喘疾病发生过程中的作用的研究也日益增多。因此,很有必要深入了解表观遗传学与哮喘发病机制之间的联系,为今后哮喘的治疗提供新的思路与靶点。

1 组蛋白修饰与哮喘

1·1 ASM 组蛋白修饰与哮喘气道炎症 哮喘是一种以气道慢性炎症为特征的异质性疾病。气道结构细胞和炎症细胞分泌的多种炎症介质和细胞因子的相互作用构成了一个复杂的网络,最终导致气道慢性炎症。ASM 细胞具有重要的合成功能,通过产生炎症介质,包括组胺、前列腺素、白三烯、细胞因子、趋化因子和内皮素,促进炎症的发生与发展。引起炎症的几种趋化因子可使炎症细胞募集,而这些趋化因子受ASM 组蛋白修饰的调节。例如,嗜酸粒细胞趋化因子 (Eotaxin)属于C 型化学趋化因子家族成员之一,可活化及募集嗜酸性细胞,从而激发哮喘的发生。Ahmadi等[3]研究发现,哮喘患者支气管黏膜中Eotaxin表达水平显著升高,且与嗜酸性细胞计数呈正相关,提示Eotaxin可通过募集嗜酸性细胞而参与炎性反应并引起组织损害主要负责嗜酸粒细胞渗入到炎症部位。研究发现,与健康人相比,哮喘患者支气管活检ASM 中的组蛋白乙酰转移酶 (histone acetyltransferase,HAT)活性增加,而组蛋白去乙酰转移酶 (Histone deacetyltransferase,HDAC)活性降低,组蛋白h4 乙酰化增加,诱导ASM 过度表达Eotaxin蛋白,从而促进炎症。CXCL8 是中性粒细胞趋化剂,其主要作用是募集中性粒细胞从血管趋向炎症或损伤部位迁移,参与局部和全身的炎症反应。哮喘患者的ASM由于h3赖氨酸18 在cxcl8 启动子处发生乙酰化,从而使HAT p300的募集作用增强,导致CXCL8过度分泌,从而加剧炎症。CXCL10是CXC趋化因子家族的一员,由干扰素γ (interferon-γ,IFN-γ)诱导刺激单核细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、成纤维细胞和内皮细胞分泌产生。CXCL10通过与其在靶细胞Th1细胞上的特异性受体相结合,利用一系列信号转导途径,趋化炎症因子到炎症部位,介导免疫细胞的迁移、聚集,表现出促炎症反应及调节血管生成的特性。此外,CXCL10 与异性受体相结合后可调节T 细胞的分化与成熟,介导Th0细胞向Th1细胞分化,发挥免疫破坏作用。在哮喘患者中,ASM 细胞组蛋白h4乙酰化[4],能够通过募集肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factorα,TNF-α)和IFN-γ诱导表达CXCL10,从多方面调节气道炎症。血管细胞黏附分子1 (vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)负责招募和增加多形核白细胞的浸润。黏附分子发生乙酰化也是引起气道炎症的启动因素。ASM 细胞中HAT p300和组蛋白h4乙酰化,募集TNF-α、内皮素1和IL-1βHAT,诱导上调VCAM-1的表达从而促进炎症。此外,HDAC4通过p300独立通路调节TNF-α和IL-1β 诱 导 的 VCAM-1 表 达[5]。 环 氧 化 酶(cyclooxygenase,COX)是一种双功能酶,主要分为固有型COX (COX-1)和诱生型COX (COX-2)。炎症损伤主要通过刺激单核细胞,巨噬细胞,成纤维细胞,血管平滑肌或内皮细胞等,诱导COX-2生成,COX-2是触发后续炎症反应的关键环节。COX-2 在正常组织细胞内的活性极低,当细胞受到炎症等刺激时,其在炎症细胞中的表达水平可升高至正常水平的10～80倍,引起炎症部位前列腺素含量增加,导致炎症反应和组织损伤。在人ASM 细胞中,组蛋白H4赖氨酸乙酰化后产生一种特定的刺激方式,在缓激肽和IL-1β介导下,对COX-2转录调控,从而参与哮喘气道炎症反应。总的来说,HAT 激活、组蛋白H3 和H4乙酰化与ASM 细胞中一些趋化因子和炎症蛋白的合成密切相关,参与哮喘气道炎症反应过程。

1·2 ASM 组蛋白修饰与哮喘气道重塑 哮喘长期反复发作,可见支气管平滑肌肥大/增生、气道上皮细胞黏液化生、上皮下胶原沉积和纤维化、血管增生以及基底膜增厚等气道重塑的表现。基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9,MMP-9)具有降解细胞外基质和基底膜的作用,参与气道重塑。MMP-9刺激与基质相关的生长因子 (如TNF-α、转化生长因子β)的释放,诱导细胞分化、增殖,促使气道重塑的形成;刺激纤维细胞增殖和胶原生成,促进气道纤维化,另外,还可参与血管生成及气道血管重塑。研究发现,在哮喘患者肺组织中,MMP-9表达明显升高,体外实验进一步证实,p300 21介导的组蛋白h3发生乙酰化是MMP-9在ASM 中的表达上调的机制[6]。因此,组蛋白乙酰化在哮喘气道重塑发生过程中也发挥重要作用。

1·3 ASM 组蛋白修饰与气道收缩 哮喘的ASM 收缩性增加与气道高反应性相关[7]。组蛋白修饰具有调节ASM收缩性的作用。Trichostatin A (TSA)是一种HDAC抑制剂。在小鼠体内废除乙酰胆碱可诱导气道高反应性,体外实验进一步证实,TSA 能抑制激动剂诱导的收缩,其机制可能是通过干扰Ca2+释放。在一例哮喘小鼠模型中发现,TSA 减弱气道高反应性[8]。HDAC8调节ASM 收缩力[9]。HDAC抑制剂苯甲酰苯胺羟肟酸二胺和MGCD0103,抑制抗原以及组胺、5-羟色胺和卡巴胆碱诱导的致敏豚鼠气管环收缩作用[10]。然而,应该注意的是,这些HDAC 抑制剂是钝性的药理学工具,具有潜在的靶向效应和结果,可以靶向作用组蛋白以外的蛋白质,这也是HAT/HDAC 抑制剂在以后治疗方面面临的挑战。

2 甲基化修饰与哮喘

目前,关于甲基化修饰如何调节ASM 中炎症趋化因子分泌的研究数据较少。但实验发现,组蛋白精氨酸甲基转移酶在严重哮喘患者的肺部组织切片和分离的ASM 细胞中的表达增加[11]。在动物实验中,大鼠在抗原刺激产生肺部炎症后,蛋白质精氨酸甲基转移酶表达上调[12]。进一步研究发现,蛋白质精氨酸甲基转移酶抑制剂能够减少ASM 细胞活性、增殖、细胞外基质沉积、细胞迁移以及还原α-SMA、胶原蛋白Ⅰ型、纤维连蛋白表达,从而抑制气道重塑。因此认为组蛋白精氨酸甲基化修饰与严重哮喘患者的气道重塑相关。

血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种重要的促血管生成因子,调节血管渗透性。Clifford等[11]认为,VEGF 还能调节肺泡上皮细胞及血管内皮细胞的凋亡,在慢性炎症性气道疾病的气道重塑中起作用。组蛋白赖氨酸甲基转移酶G9a能够通过阻止赖氨酸9在组蛋白H3上三甲基化,调节Sp1和RNA 聚合酶Ⅱ结合,从而抑制血管内皮生长因子的转录表达。哮喘患者中,由于组蛋白赖氨酸甲基化的异常导致赖氨酸9招募失败,使ASM 过度分泌VEGF[11],促进气道重塑。

研究发现,健康人和哮喘受试者ASM 的DNA 甲基化程度不同,且随疾病严重程度而改变。此外,健康人与非严重哮喘患者相比,甲基化位置不同,表现为细胞增殖和细胞凋亡基线水平不同,与ASM 收缩、增殖密切相关[13]。哮喘患者ASM 中磷酸二酯酶启动子发生甲基化,导致其过度表达,降低Ca2+信号的下游效应器,包括肌球蛋白轻链激酶和p38蛋白激酶 (p38 MAPK)的磷酸化水平,从而减少细胞增殖和迁移[14]。在大鼠ASM 中,DNA 甲基转移酶抑制剂5-aza-2′-脱氧胞苷通过对DNA 甲基转移酶1的影响,抑制血小板洐生生长因子诱导的收缩力增加、迁移和增殖[15]。因此,DNA 甲基化通过对ASM 收缩、迁移和增殖的影响,参与调控哮喘气道重塑。

3 非编码RNA与哮喘

非编码RNA 由DNA 转录而来,调节蛋白质编码基因的转录,影响其稳定性和翻译。目前研究最广泛的非编码RNA 是micrornas (miRNA)。这些miRNA 是由19～24个核苷酸长的单链RNA 组成,通过整合到下游基因靶m RNA 的3′-未翻译区,介导翻译抑制、信使RNA(m RNA)退化。不同的miRNA 能够对ASM 不同的功能进行调控,从而参与哮喘发生的各个病理过程,例如:(1)miRNA-217抑制转化生长因子β1 诱导的ASM 细胞增殖和迁移;miRNA-10a通过靶向PI3激酶,降低有丝分裂原诱导的ASM 增殖;miRNA-203通过控制c-abl表达,调节细胞外调节蛋白激酶激活,从而抑制ASM 细胞增殖;miRNA-138通过改变丙酮酸脱氢酶激酶1表达和对PI3K信号通路的调节,来减少ASM 的增殖;miRNA-21激活磷酸酰肌醇-3-激酶 (PI3K),增加ASM 的增殖和迁移;miRNA-135a通过Tr PC1负调控ASM 增殖;miRNA-143-3p抑制ASM 细胞增殖和细胞外基质蛋白沉积;miRNA-139-5P抑制ASM 增殖并促进其凋亡;miRNA-23b通过负性调节NFATC1信号通路,控制ASM 增殖;miRNA-150通过下调BCYRN1,减弱ASM 细胞的活力,抑制其增殖和迁移;miRNA-638 通过靶向作用细胞周期蛋白D1 和NOR1,抑制ASM 细胞增殖和迁移;上述这些不同的miRNA 通过对ASM 增殖、迁移动的影响而对哮喘气道重塑产生正性和负性的调控作用[16-18]。(2)miRNA-708通过结合CD38 的3′UTR,调节JNK MAPK 和PI3K 信号通路,抑制TNF-α 介导的ASM 中CD38 的表达;miRNA-146a负性调节COX-2和IL-1的表达;miRNA-145上调Ⅰ型胶原和收缩蛋白MHC 的表达,负性调节促炎因子的释放;miRNA-221能够增强重度哮喘患者ASM 的增殖和IL-6释放;miRNA-155 增强COX-2 表达和PGE2 分泌;miRNA-708,miRNA140～3P下调TNF-α诱导的促炎基因表达;上述这些不同的miRNA 通过以上各种机制参与哮喘气道炎症[19]。此外,miRNA-133a能够通过负性调节支气管平滑肌收缩关键蛋白——rhoa的表达,调控气道的高反应性[20]。

4 表观遗传修饰与哮喘药物治疗

许多用于哮喘治疗的药物,包括皮质类固醇、β2受体激动剂,茶碱和孟鲁司特虽然不是针对表观遗传变化设计的,但有一些药物能对组蛋白和组蛋白修饰酶产生影响。糖皮质激素和长效β2受体激动剂联合治疗能够有效地改善哮喘症状和减少哮喘恶化,是目前治疗哮喘的主要药物[16]。然而,糖皮质激素和β2受体激动剂均可以改变ASM 中的组蛋白乙酰化。β2受体激动剂和糖皮质激素通过选择性抑制组蛋白H4乙酰化和核因子κB p65与人嗜酸细胞趋化因子启动子的结合,抑制TNF-α诱导的嗜酸细胞趋化因子的基因转录[21]。茶碱已用于治疗哮喘超过70 年,茶碱通过磷酸二酯酶抑制剂舒张ASM,但其有助于抗炎的特性也可能诱导出组蛋白去乙酰化酶[22]。孟鲁司特、半胱氨酸白三烯受体拮抗剂,通过组蛋白H3乙酰化,增强脂多糖诱导的抗炎因子IL-10 在人骨髓树突状细胞中的表达[23]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂 (用于糖尿病)通过抑制ASM 组蛋白H4 乙酰化,抑制TNF-α诱导的嗜酸细胞趋化因子的基因转录,但一项关于哮喘的临床研究由于发现药物的致癌作用而被终止。

表观遗传修饰的可逆性使其成为理想的治疗哮喘的靶点。如果能够将组蛋白修饰酶定位于特定的促炎性启动子或一些具有相似细胞功能的基因的启动子,那么对于治疗哮喘显然是有益的。姜黄素是一个HAT 抑制剂,能够降低IL-1β诱导人气道平滑肌细胞释放嗜酸粒细胞趋化蛋白和MCP-1[24-25],在小鼠哮喘模型实验中,姜黄素能够诱导大鼠ASM 增殖和减少ASM 质量。并且在临床实践中,姜黄素减少哮喘患者气道阻塞[26]。但姜黄素对HAT 的抑制作用缺乏选择性,难以达到靶向治疗的目的,需要更多选择性的HAT 抑制剂。目前,针对表观遗传修饰过程中的选择性抑制剂在一些慢性炎症性疾病和肿瘤的研究正在开展。溴域和端外 (bromodomain and extraterminal,BET)蛋白是一个识别组氨酸赖氨酸残基乙酰化的蛋白质家族,BET 抑制剂在肿瘤和炎症等临床前疾病模型中表现出良好的疗效,且已有部分抑制剂进入临床阶段,这表明以BET为治疗靶点的药物研发具有可观前景[27]。BET 抑制剂通过扰乱BRD4和RNA 聚合酶Ⅱ与启动子的关联,能够减少ASM 的CXCL8分泌。但这些在哮喘中的研究数据目前还未有报道。

尽管哮喘的表观遗传学研究还处于起步阶段,有证据表明组蛋白修饰和其他表观遗传机制对调节ASM 的功能具有关键作用。研究表明,ASM 表观遗传修饰不仅仅是对外界刺激等作出的适应性反应,更是哮喘的气道炎症和重塑的驱动因素。与这一观点相一致的是,ASM 热成形消融术对哮喘有获益。哮喘患者的ASM 细胞在CXCL8 和VEGF的组蛋白乙酰化和甲基化失调,可能分别是导致炎症细胞流入和哮喘气道重塑的启动因素。针对这些与哮喘密切相关的失调的表观遗传机制的研究,为今后的哮喘治疗提供了新的途径。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突