基于Cytb基因序列对牛肉制品掺假鉴定的研究进展

田茂秀，余勤艳，李艳情，王绍平，陆龙波，李 丽

（铜仁学院，贵州 铜仁 554300）

牛肉中含有丰富的氨基酸和Fe2+、Ga2+等离子，具有高蛋白，低脂肪，适宜对脂肪需求量比较少的人食用[1-3]。牛肉在中国的销量仅次于猪肉。牛肉因其蛋白质等成分更接近人类所需，故价格高于羊、猪、鸡、鸭、等禽肉。由于利益的驱动，一些不良商家为了博取更多的经济利益，以廉价的肉制品代替牛肉。近年来，肉制品掺假事件层出不穷。如欧洲的马肉事件[4]，沃尔玛济南泉城分店销售的五香牛肉掺假狐狸和貉肉[5]，上海鸡肉染色变牛肉事件。掺假的方法有以低价值的原料代替高价值的原料，从而减少原料上的成本，还有添加不法添加物掩盖不良肉制品的现象。传统的鉴定方法有感官评价法、三酰甘油光谱法、近红外光谱法[6]、血清免疫鉴定法。上述方法虽然可以鉴定，但由于操作较复杂，对工作人员的专业水平要求较高，因此较少使用。而基于DNA 鉴定的方法准确、高效、而成为研究的热点。近年来，基于DNA鉴定的方法主要有荧光PCR法、多重PCR法、环介导等温扩增法、DNA条形码技术、重组酶介导等温扩增技术。本文主要基于牛Cytb基因的技术、原理、应用来进行综述，希望能给肉制品鉴定提供一定的理论依据。

1 肉制品常见掺假方法

肉制品掺假分为来源欺骗、成分改变、加工过程和非肉质成分的添加。来源欺骗，商家主要以牲畜的商标、年龄、大小、质量来欺骗顾客，如风靡全国的注水猪肉事件、瘦肉精事件，成分代替是以低廉的肉制品冒充昂贵的肉制品，有的商家甚至用不可以食用的狐狸、马肉、猫肉来冒充牛肉[7]。

2 基于DNA技术的肉制品掺假鉴定技术

2.1 环介导等链置换型DNA等温扩增法

环介导等链置换型DNA等温扩增法（loopmediated isothermal amplification）是2000年研究出来的一种核酸恒温扩增方法。通过对目的基因的6个区域设计4条引物，在恒温的条件下与链置换型DNA聚合酶在等温（60～65℃）下1 h内进行扩增反应，可以实现109～1 010倍的扩增，与一般的PCR技术相比，LAMP技术操作较简单，灵敏度较高，扩增效率高，不依赖于专门的仪器与设备，检测成本低。观察结果方便，直接用视觉观察有无白色沉淀和绿色荧光即可，无须进行凝胶电泳成像。邵长春[8]等人通过对猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytb特异性基因分别设计引物，通过检测荧光强度判断反应结果，通过循环数与荧光强度的关系，结果得出猪、牛检测灵敏度为10 pg，牛的检测灵敏度为1pg，结论为LAMP技术检出限强、灵敏度高。

2.2 多重PCR法

多重PCR法是在同一个PCR扩增体系中同时加入两对或者两对以上引物同时进行扩增的技术。其原理与普通PCR法相同，DNA在90℃高温时发生解旋，当温度降到60℃左右时，引物与单链按照碱基互补配对原则进行复制，当温度继续降到72℃，即DNA聚合酶的最适温度，在DNA聚合酶的作用下，新扩增出来的子链与母链结合。多重PCR法具有高效性，能同时检出多种肉制品，节约时间与试剂，减少经费的开支。李盈诺[9]等人成功地用特异性多重PCR检测出3种肉。何玮玲[10]等人建立了一种快速用于食品中4种肉类鉴别的通用引物PCR法，结果表明，该法可用于食品中多种动物源性成分的检测。

2.3 荧光PCR法

荧光PCR法的检测方法有DNA结合染料、水解探针（TaqMan）、分子信标、荧光标记引物和杂交探针，最常用的有SYBRGreenl法与TaqMan探针法。SYBGreenl法是在PCR体系中加入荧光染料，荧光染料特异性地与双链DNA结合，发出荧光，实行在线跟踪DNA的过程的一种方法。与荧光染料特异性结合的，荧光染料则发出很强的荧光，未结合的则没有通过。通过软件对产物进行分析，通过软件所得出的图对扩增产物进行定量分析。TaqMan法则是利用TaqMan探针5'末端携带荧光基团，3'携带淬灭基团，PCR扩增时，同时加入一对引物和特异性的荧光探针，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收，Taq的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团与淬灭基团分离，荧光检测系统便能够检测到荧光信号，每增加一个荧光信号分子，则扩增了一条DNA链。胡莲霞[11]等人将4种肉粉中分别混入2～3种肉粉，应用GNM C7—8实时荧光PCR系统和AB17500荧光PCR方法对以上掺假的肉制品进行检测和比对，结果显示GNM C7—8实时荧光PCR系统能单独对多种肉制品进行检测。

2.4 DNA条形码技术

DNA条形码是指在生物体内能够代表物种的，有足够变异能力的，短的易扩增的DNA 片段，高玉时[12]等人以线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ为DNA条形码对不同品种的鸡进行鉴定。王洁[13]以线粒体细胞色素C氧化酶I基因标记物种，对3个地方不同的鸭进行检测。

3 讨论

环介等链置换DNA等温扩增法、多重PCR法、荧光PCR法、DNA条形码技术 4种技术常常被用在肉制品的掺假鉴定中，但各自均有局限。环介等链置换DNA等温扩增法灵敏度高，扩增速率快，且扩增的过程中不需要特殊仪器，操作简单，但是灵敏度高，开盖容易形成气溶胶污染，假阳性严重，引物的设计要求也比较高。多重PCR法经济、节约、快速，但是需多次摸索反应的条件，且非特异性扩增容易出现假阳性。荧光PCR技术无须电泳、测序等复杂的操作，不仅节约时间而且节约精力，扩增速度快，灵敏度高。DNA条形码技术准确性高、建立DNA条形码数据库，可同时并快速鉴定大量样本，进行非专家物种鉴定。