胃癌中ANP表达与BMP信号通路相互作用对细胞侵袭、转移的影响

2020-03-05 05:43郝美玲刘海旺李春辉
临床与实验病理学杂志 2020年1期
关键词:结果显示阴性胃癌

郝美玲,程 玉,刘海旺,李春辉

胃癌发病率及病死率较高,2015年中国癌症数据报告我国每年胃癌新发患者67.9万例,死亡患者49.8万例[1]。研究显示有些肿瘤细胞中BMP信号通路的抑制剂可通过抑制BMP信号通路,调节基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)表达影响肿瘤细胞的侵袭和转移[2]。目前,胃癌中心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)通过抑制BMP信号转导通路调节MMP的表达影响胃癌细胞的侵袭和转移,但具体机制尚未见报道。本文着重探讨ANP在胃癌组织和胃癌细胞中的表达,分析ANP表达与BMP信号通路相互作用对细胞侵袭、转移的影响,为胃癌的发病机制及靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集承德医学院附属医院病理科2018年1月~2018年9月存档的胃癌标本60例和距肿瘤边缘≥5 cm正常胃黏膜组织60例。纳入标准:患者术前均未行放、化疗和免疫治疗,具有手术治疗适应症,符合胃腺癌手术病理学诊断标准。按美国癌症分期联合委员会(American Joint Committee on Cancer Staging, AJCC)第7版进行分期,男性49例,女性11例;年龄35~81岁,中位年龄58岁;根据WHO(2010)消化系统肿瘤进行组织学分型,其中高分化1例,中分化30例,低分化29例。胃癌细胞株MGC-803由承德医学院基础医学研究所馈赠。

1.2 免疫组化将收集的组织常规取材,石蜡包埋,切片。采用免疫组化EnVision法染色,具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。ANP定位于细胞质中,呈棕黄色颗粒为阳性。应用半定量积分法进行染色细胞的判读,随机选取10个高倍视野。(1)根据阳性细胞百分数计分:阳性细胞数≤25%为1分,26%~50%为2分,>50%为3分;(2)根据阳性细胞染色强度计分:未着色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分[3-4]。将两项得分结果相乘:0~3分为阴性,4~6分为阳性。

1.3 细胞培养胃癌细胞株MGC-803置于含10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液中,于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养。培养后的胃癌细胞MGC-803分为两组:加入ANP组(ANP阳性组)、未加入ANP组(ANP阴性组)。

1.4 Western blot法提取组织及处理后对MGC-803细胞中的蛋白进行标记,存于-80 ℃冰箱中,备用。取等量蛋白置于加样孔中进行电泳、转膜、封闭、加入一抗(1 ∶200)、洗膜、加入二抗及洗膜后,于暗室进行显影,实验结果以胶片上条带的方式呈现。

1.5 CCK8法将ANP阳性组与ANP阴性组中的MGC-803细胞制备成单细胞悬液,分别接种于96孔板中(每孔2 000个),每个时间点设置5个复孔,设立空白对照组即不含细胞的培养基,分别于4、24、48、72 h在上述培养孔中加入终浓度为10%的CCK8试剂,于37 ℃培养箱中继续孵育2 h,最后利用酶标仪测定450 nm的吸光度值,并绘制肿瘤细胞的生长曲线。细胞存活率(%)=(ANP阳性组OD值-空白组OD值)/(ANP阴性组OD值-空白组OD值)×100%,所得数据进行分析。

1.6 Transwell实验将基膜基质原液置于4 ℃冰箱过夜融化,将基膜基质原液和预冷的无血清 RPMI 1640 培养液按1 ∶3的比例配制侵袭小室的上室凝胶液,每孔 50 μL 包被侵袭小室的上室,放置 37 ℃ 孵育箱孵育2 h使其成胶。将MGC-803细胞消化制备细胞悬液,Transwell小室上室每孔接种200 μL 不含血清细胞悬液,下室加入含 10%胎牛血清RPMI 1640 培养液500 μL。将Transwell 板置于培养箱中继续培养24 h后用结晶紫染色。通过显微镜观察被染色的细胞,并进行计数。

2 结果

2.1 ANP的表达与胃癌临床病理特征的关系免疫组化法检测60例胃癌组织及对应的正常胃组织中ANP蛋白的表达,结果显示,ANP蛋白在胃癌组织中的阳性率(18.3%,11/60)低于正常胃组织(78.3%, 47/60),差异有统计学意义(χ2=19.26,P<0.05,图1)。本实验结果显示,ANP蛋白与患者年龄、性别、TNM分期、组织学分型、浸润深度及淋巴结转移均无明显相关性(P均>0.05,表1)。

2.2 ANP对MGC-803细胞增殖和侵袭的影响采用CCK8法检测ANP阳性组和ANP阴性组中胃癌细胞MGC-803增殖速度的变化,结果显示:与ANP阴性组相比,ANP阳性组胃癌细胞的增殖速率下降(P<0.05,表2)。采用Transwell实验检测ANP阳性组和ANP阴性组中胃癌细胞MGC-803侵袭能力,结果显示:ANP作用于胃癌细胞MGC-803 24 h后,ANP阳性组细胞在4、24 h穿过的小孔细胞数分别为(34.72±7.92)个、(114.67±19.27)个,ANP阴性组分别为(54.72±7.84)个、(221.91±17.59)个,两组之间差异有统计学意义(P<0.05,图2)。

图1A. 正常胃黏膜组织中ANP呈强阳性,定位于细胞质,EnVision法;B. 胃腺癌组织中ANP呈阳性,定位于细胞质,EnVision法图2Transwell实验检测ANP阳性组和ANP阴性组中胃癌细胞MGC-803的侵袭能力:A. 4 h后ANP阳性组中胃癌细胞穿孔细胞数;B. 24 h后ANP阳性组中胃癌细胞穿孔细胞数;C. 4 h后ANP阴性组中胃癌细胞穿孔细胞数;D. 24 h后ANP阴性组中胃癌细胞穿孔细胞数

表1 胃癌临床病理特征与ANP表达的关系

表2 ANP阴性组和ANP阳性组中胃癌细胞MGC-803在不同时间生长速率的变化(%)

与ANP阴性组相比,*P<0.05

2.3 ANP对不同蛋白表达的影响采用Western blot法检测ANP阳性组和ANP阴性组胃癌细胞中BMP通路相关蛋白BMP6/7、Smad1/5、p-Smad1/5的相对表达量,结果显示ANP阳性组中BMP6/7、p-Smad1/5的相对表达量[(0.94±0.09)、(1.22±0.10)]比ANP阴性组[(0.24±0.02)、(0.55±0.07)]高,差异有统计学意义(P均<0.05);Smad1/5的ANP阳性组相对表达量(0.30±0.04)比ANP阴性组(0.52±0.04)减少,差异有统计学意义(P<0.05);提示ANP可以激活BMP信号通路的信号传导能力。

Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白在ANP阳性组的相对表达量[(0.85±0.10)、(0.25±0.03)、(0.37±0.04)]比ANP阴性组[(1.13±0.10)、(0.44±0.03)、(0.66±0.07)]均减少,差异有统计学意义(P均<0.05);提示ANP阳性组胃癌细胞的增殖能力比阴性组下降,且MMP-2、MMP-9蛋白表达减少,降解细胞外基质的能力下降,细胞的侵袭转移能力也有所下降(图3)。

图3 Western blot法检测ANP阳性组和ANP阴性组中胃癌细胞MGC-803与BMP信号通路活化的作用及对胃癌细胞侵袭转移的影响:A. ANP阳性组和ANP阴性组中BMP通路相关蛋白BMP6/7、Smad1/5、p-Smad1/5的表达;B. ANP阳性组和ANP阴性组中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的表达;C. ANP阳性组和ANP阴性组中BMP6/7、Smad1/5、p-Smad1/5、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的相对表达量,*P<0.05

3 讨论

胃癌的发病率及病死率在恶性肿瘤中一直居高不下,呈逐年上升趋势。早期胃癌多无症状,发现时多为中晚期,患者预后差,生存质量下降,然而关于胃癌的发病机制尚不清楚[1],因此探讨胃癌的发病机制成为研究热点。

ANP具有扩血管、利尿、拮抗神经内分泌激素等多种作用,在心血管中报道较多[5]。目前ANP在肿瘤中的研究较少,日本学者发现ANP可抑制肺癌细胞的侵袭转移[6],且ANP抑制胃癌细胞的侵袭转移及在胃癌组织中的表达罕见报道。Li等[7]通过电镜观察ANP合成细胞存在于大鼠的胃黏膜组织中,在人正常胃黏膜中也有ANP的表达,定位于胃黏膜细胞的胞质中,本组免疫组化结果显示ANP在胃癌细胞中的表达量低于正常胃黏膜,提示ANP表达异常与胃癌的发生有重要联系。本实验胃癌细胞MGC-803的ANP阳性组与阴性组经Transwell实验检测,发现相同时间内ANP阳性组胃癌细胞的侵袭率低于ANP阴性组,且随时间的推移越来越低;同时利用CCK8法检测两组胃癌细胞增殖率发现,ANP阳性组的胃癌细胞增殖率低于阴性组,随时间的变化越来越低,表明ANP可以降低胃癌细胞MGC-803的增殖和抑制癌细胞的侵袭。

为了明确ANP降低胃癌细胞MGC-803的增殖和抑制癌细胞侵袭的机制,本组实验检测ANP阳性组和ANP阴性组中BMP通路中相关蛋白的表达,结果显示ANP阳性组比ANP阴性组BMP-6/7和p-Smad1/5的表达升高,Smad1/5、Ki-67、MMP-2和MMP-9的表达下降。众所周知,Ki-67增殖指数下降,细胞的增殖活性降低。MMP-2和MMP-9能降解细胞外基质、影响细胞间质转化,减少细胞间黏附性,间接促进肿瘤细胞的侵袭转移。本组实验结果提示加入ANP后可能刺激BMP信号通路活化,激活Smad1/5磷酸化,影响核内Ki-67、MMP-2和MMP-9的转录及其蛋白的翻译,提高Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白的表达,使肿瘤细胞的增殖活性升高及细胞间的黏附作用减小;提示ANP可通过激活BMP信号通路,促进胃癌细胞的增殖和侵袭转移等生物学行为。

另外,本组实验收集胃癌患者的临床病理特征,并分析胃癌组织中ANP的表达及与临床病理特征的相关性。结果显示:ANP在胃癌组织中的表达与患者性别、年龄、组织学分型、浸润程度、淋巴结转移、TNM分期均无关,该结果与ANP细胞水平的实验结果有一定差异,可能与本组样本数量较少有关,故需加大样本量进一步分析。

总之,胃癌中ANP可能活化BMP信号转导通路,并可通过上调Smad1/5的磷酸化,使细胞核中某些基因转录异常,影响调控胃癌细胞增殖和降解细胞外基质的能力,发生细胞-间质转化,影响胃癌的增殖、侵袭和转移。

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