太阳热处理对小白菜根肿病防治效果的研究

沈 璐，李勤超，田中贵，稻村达也，伊日布斯，*

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明650504； 2.日本京都大学 农学研究科，日本 京都 606-8502)

根肿病是由芸薹属根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)侵染十字花科蔬菜引起的一种世界性土传疾病[1]，该病原菌传染性强，传播速度快，一经感染可以诱导植物根部细胞产生细胞分裂素和吲哚乙酸，导致感病植株根部膨大，形成大小不一、形状各异的根瘤，几乎没有侧根，严重阻碍植物根部对土壤养分和水分的吸收，使植物地上部分生长缓慢，植株矮小，甚至死亡[2-3]。研究表明，当植物形成根瘤后，其他的微生物更容易破坏植物根部，造成植物根部腐烂，同时将大量具有活性的根肿菌休眠孢子释放到土壤中引起传播[4]。根肿菌休眠孢子在自然条件下可在泥土中存活7～8年，因此田间地块一旦感病将长期不再适合种植十字花科作物[5-6]。

目前针对根肿病的防治措施主要有：(1)农业防治：在感病田间施用生石灰以提高土壤pH是防治根肿病的有效方法。然而近年来因施用生石灰所造成的土壤板结、石灰残留等问题也日益严重，长期施用生石灰使土壤pH处于碱性环境，容易导致根肿菌产生抗碱性，Donald等[7]发现土壤pH在7.2及以上时仍有根肿病发生。(2)化学防治：使用化学药剂防治十字花科蔬菜根肿病是目前市场上最常用的方法[8]。但是药剂防治花费大、费时费力，且药剂防治一般是在发现根肿病后才进行防治，一旦根肿菌完成了侵染植物的第一阶段，药剂防治将不会产生任何效果。不仅如此，近年来由于过多地使用化学药剂，使土壤中的农残积累日益严重，威胁着蔬菜的品质和人体的健康。(3)生物防治：随着科学的进步以及微生物制剂在农业生产中的推广应用，越来越多的研究显示，生物制剂对根肿菌休眠孢子的萌发及侵染有明显的抑制作用，尤其是枯草芽孢杆菌[9]和解淀粉芽孢杆菌[10]在防治根肿病方面表现出良好的应用前景，但是目前仍然处于研究阶段。(4)抗病育种[11-12]：理论上抗病育种是防治根肿病最直接有效的方法，然而根肿菌生理小种较多，不同的抗病品种对不同的根肿菌生理小种变种表现出不同的抗性，而且不能针对性地应用抗病品种，这是限制抗病品种种植的主要因素。因此，寻找经济环保且能有效防治根肿病的方法是目前十字花科蔬菜最急需解决的问题之一。

土壤太阳热处理是一种环保、有效的土壤消毒方法，使用后无土壤板结及农残积累等问题。在早期的研究过程中，人们常认为太阳热处理主要通过提高土壤的温度，抑制或杀死了土壤中的病原菌，有利于植物的健康生长[13-14]。2012年Marahatta等[15]发现太阳热不仅能够通过提高温度以杀死土壤中的病原菌、抑制杂草种子的萌发，还可以明显提高土壤微生物活性，增加植株产量。由于操作简单、费用低且环保无污染，因此太阳热处理具有广阔的应用前景[16-17]。本研究以小白菜为供试材料，测定太阳热处理前后的土壤理化性质、根肿菌休眠孢子数量、土壤微生物多样性及发病率等变化情况，对太阳热处理于小白菜根肿病的影响作出评价。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地设置在云南省嵩明县小街镇，试验地土壤为沙壤土，中等肥力，微生物群落丰富，是小白菜根肿病的高发区。

1.2 试验材料

试验所用小白菜品种为超级小黄白。

1.3 试验试剂

荧光增白剂(M2R)：由Sigma公司提供；溴化乙锭(EB)、氢氧化钠(NaOH)和六偏磷酸钠(SHMP)：均购自上海生工生物技术有限公司。

1.4 试验设计

将试验地大棚平均分为2个处理区，包括非太阳热处理区A和太阳热处理区B。按照图1采样点的分布形式使用土壤采样器分别采集深度为0～10 cm和10～20 cm处的土壤层样品，每种样品采集约2 kg。完成样品采集后，对大棚进行深耕，并在每个处理区选择适当的试验点放置温度计以测量在太阳热处理期间土壤温度的变化情况，随后对大棚进行灌水处理，使土壤水分充分饱和，时间约30 min。最后在太阳热处理区B覆盖一层普通农用聚乙烯薄膜，封闭大棚30 d。太阳热处理结束后再次采集土壤样品(采样点同第一次)，用于pH值和根肿菌休眠孢子数量的测定。

图1 采样点分布图Fig.1 Sampling point distribution

第一次采样时间：2015年5月1日(处理前的土壤样品)；第二次采样时间：2015年6月2日(处理后的土壤样品)；太阳热处理时间：2015年5月1日—2015年6月2日。

1.5 试验方法

1.5.1 土壤温度和pH值的测定

使用温度计(Thermo Recorder TR-52)实时记录温度值。将温度计从1开始编号，按编号顺序将每2个温度计分为1组，将每组奇数编号温度计的一端埋入土壤10 cm处进行测量，偶数编号温度计的一端埋入土壤20 cm处进行测量，在距地面1 m处放置3个温度计，测大棚内温度。太阳热处理结束后使用T&D for Windows T-51/T-52读取温度计温度并分析。

称量10 g土壤样品，加25 mL去离子水溶解，静置25 min，使用pH计测土壤的pH值。

1.5.2 土壤根肿菌休眠孢子数量的测定

参照Shinoda等[18]的方法检测土壤中根肿菌休眠孢子的数量。称取20 g风干的土壤样品与400 mL六偏磷酸钠溶液混合均匀，并将pH调整到10，然后在180 W功率下对土壤泥浆溶液进行超声波破碎，时间为10 min。将破碎过的土壤泥浆溶液pH调整到9，充分混匀后吸取40 mL混合液通过8层125 μm的筛网过滤，定容至100 mL。吸取300 μL混合液与等量的荧光增白剂和溴化乙锭充分混匀。在血球计数板两侧各加入10 μL染色的休眠孢子溶液，于400倍荧光显微镜下镜检。

1.5.3 太阳热处理对小白菜根肿病防治效果

将采集的土壤样品与腐殖土(121 ℃灭菌30 min)按体积比为1∶9的比例混合(采集的土壤样品5 mL∶腐殖土45 mL)，每个土壤样品3次重复。在每个培养盘穴中播8～10粒白菜种子，出苗后6～8 d内长出2～4片子叶时，剪去生长不良的白菜幼苗，只留一株健康的白菜幼苗，种植周期约32 d。

参考司军等[19]的方法判断小白菜根肿病的发病等级(图2)。0级，根部无肿瘤，根系发育正常；1级，根系主根不发病或不明显，侧根有小肿瘤；2级，侧根肿瘤大，且主根有小肿瘤；3级，主根明显肿大，无须根。

发病率=感病植株/统计的总株数×100%。

病情指数=∑(各级发病株数×各级代表数值)/(调查总株树×最高病情级数)。

1.5.4 太阳热处理对土壤细菌微生物多样性影响

(1)土壤总DNA的提取

称取0.25 g土壤样品，3个重复。用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒提取土壤总DNA，详细操作步骤参考试剂盒说明书，随后用0.8%琼脂糖凝胶检测DNA条带。土壤DNA保存于-20 ℃冰箱待用。

(2)土壤微生物的PCR扩增

将提取的土壤总DNA稀释10倍作为聚合酶链式反应的模板，使用细菌通用引物扩增细菌16S rDNA V3～V5区[20-21]，引物1为341F 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，引物2为907R 5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′。

反应体系：10×TaqBuffer 2 μL、dNTP(10 mmol·L-1)1.6 μL、引物1为0.4 μL、引物2为0.4 μL、TaqDNA polymerase 0.2 μL、模板1 μL、加入去离子水14.4 μL至20 μL反应体系，每次PCR反应均设置无菌水的阴性对照。

扩增条件：预变性94 ℃；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增结束后使用琼脂糖凝胶电泳检测土壤细菌PCR产物。

(3)变性梯度凝胶电泳(DGGE)

DGGE胶的浓度范围为45%～60%，在电压60 V的条件下电泳13 h。电泳结束后进行照胶分析。

图2 根肿病分级标准Fig.2 Different-grade symptom of clubroot

(4)DGGE图谱显著性条带的割胶、克隆和测序

利用北京百泰克生物技术有限公司多功能DNA纯化回收试剂盒对优势菌进行割胶回收，取优势条带过夜溶解离心的上清液为模板进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件均与PCR-DGGE相同。然后交由昆明硕擎生物科技有限公司测序，测得的序列通过BLAST进行比对分析。

1.5.5 数据处理与分析

通过Microsoft Excel整理实验数据，采用SPSS11.0和R软件对数据进行统计分析并计算土壤微生物的香浓维纳指数。利用Image Lab软件(Bio-Rad)将不同位置和不同灰度的DGGE条带进行数字化处理，随后对得到的DGGE条带数据信息进行标准化处理。

2 结果与分析

2.1 太阳热处理对土壤温度的影响

在太阳热处理期间，大棚内最高温度56.2 ℃，最低温度10.4 ℃，平均温度27.8 ℃，30 ℃以上累计时间245.3 h，35 ℃以上累计时间189.8 h，40 ℃以上累计时间134 h。在非太阳热处理区A，土壤10 cm处的最高温度41.3 ℃，最低温度18.1 ℃，平均温度为29.1 ℃，30 ℃以上累计时间259.2 h，35 ℃以上累计时间108.7 h，40 ℃以上累计时间5.3 h，在土壤 20 cm处的最高温度32.8 ℃，最低温度20.3 ℃，平均温度为27.3 ℃，30 ℃以上累计时间69.7 h。在太阳热处理区B，土壤10 cm处的最高温度可达46.1 ℃，最低温度20.5 ℃，平均温度为33.2 ℃，30 ℃以上累计时间451.5 h，35 ℃以上累计时间222.5 h，40 ℃以上累计时间73.2 h，在土壤20 cm处的最高温度39 ℃，最低温度20.8℃，平均温度为31 ℃，30 ℃以上累计时间399.3 h，35 ℃以上累计时间62.2 h(图3)。

分析结果表明，在太阳热处理区B 10 cm和20 cm处土壤的最高温度、最低温度、平均温度及>30 ℃、>35 ℃、>40 ℃的累计时间(h)均明显高于非太阳热处理区A，且在太阳热处理区土壤10 cm处>40 ℃累计时间和温度的提高幅度明显高于土壤20 cm处。其中太阳热处理区10～20 cm处>30 ℃累计时间(399.3 h)较非处理区(69.7 h)增加了330.6 h，累计时间明显增加。大棚土壤温差变化明显小于大棚内的温度变化，而且0～10 cm处温差(25.6 ℃)高于10～20 cm处温差(12.5 ℃)，表明土层越深，温差变化越小(表1)。

2.2 太阳热处理对土壤pH的影响

试验前，对照区A的0～10 cm和10～20 cm处土壤的pH分别为4.76、4.88，太阳热处理区B的0～10 cm和10～20 cm处土壤的pH分别为4.96、5.02。试验后，A区的0～10 cm和10～20 cm处土壤的pH分别为4.97、5.07，B区的0～10 cm和10～20 cm处土壤的pH分别为5.60、5.78，结果表明太阳热处理明显提高了土壤的pH值(P<0.05)，在0～10 cm处土壤的pH值提高了0.64，而10～20 cm处土壤的pH提高了0.76(图4)。

2.3 太阳热处理对土壤根肿菌休眠孢子数量的影响

图3 太阳热处理期间土壤温度的变化Fig.3 Changes of temperature during soil solarization

表1 太阳热处理对温度的影响Table 1 Effect of solarization on temperature

图4 太阳热处理对土壤pH的影响Fig.4 Effects of solarization on soil pH

试验前，太阳热处理区B土壤0～10 cm处样品中有活性的根肿菌休眠孢子数量为1.09×106g-1，10～20 cm处风干土壤中有活性的根肿菌休眠孢子数量为1.13×106g-1。太阳热处理后，0～10 cm处的根肿菌休眠孢子数量减少至5.74×105g-1，而10～20 cm的根肿菌休眠孢子数量为9.74×105g-1，结果表明，太阳热处理使土壤0～10 cm处根肿菌休眠孢子的数量明显降低(P<0.05)，而对10～20 cm处的根肿菌休眠孢子几乎无影响(图5)。

图5 太阳热处理对根肿菌休眠孢子的数量的影响Fig.5 Effects of solarization on resting spores of Plasmodiophora brassicae

2.4 太阳热处理白菜根肿病防治效果

分别使用试验前在对照区A采集的0～10 cm和10～20 cm处的土壤栽培白菜，根肿病的发病率和病情指数分别为84.62%、56.2以及87.1%、49.68，太阳热处理区B发病率和病情指数分别为87.1%、45.24以及82.78%、49.89。太阳热处理后，分别使用在A区采集的0～10 cm和10～20 cm处的土壤栽培白菜，根肿病的发病率和病情指数分别为88.68%、52.83以及82.69%、46.80，而B区发病率和病情指数分别为49.12%、16.96以及73.68%、36.25。经过太阳热处理的B区植物根肿病的发病率和病情指数均降低，其中在0～10 cm和10～20 cm处土壤栽培的白菜根肿病的发病率和病情指数分别降低了37.98百分点、62.51%以及9.10百分点、27.34%。统计分析结果表明，太阳热处理对0～10 cm处根肿病发病率和病情指数影响显著，而对10～20 cm处根肿病的发病率和病情指数无明显的影响(图6)。

2.5 太阳热处理对土壤细菌微生物多样性的影响

2.5.1 16SrDNA片段PCR产物检测

土壤细菌PCR产物检测结果如图7。结果表明PCR产物条带清晰，且无散带现象。片段大小约680 bp，与预计大小一致。

2.5.2 土壤细菌DGGE图谱指纹分析

图6 太阳热处理对根肿病发病率和病情指数的影响Fig.6 Effects of solarization on clubroot incidence rate and disease index

由图8-A可知，在土壤0～10 cm处，土壤细菌的条带数目较少，不同泳道条带均含有条带1、2、3(除条带16)，但这些条带在不同泳道中的强弱并不相同，如条带3在12～16泳道亮度明显降低，表明在试验后条带3所代表的细菌微生物的数量明显减少。条带4只在13～16泳道中检测到，表明在试验后条带4所代表的微生物种群富集，13～16泳道的条带数目>9～12泳道的条带数目>1～8泳道的条带数目，说明太阳热处理使土壤0～10 cm微生物群落结构更加多样化，且试验后细菌群落的多样化程度大于试验前。土壤10～20 cm处的DGGE图谱如图8-B，不同泳道均含有共同条带1、2、4，条带3只在7～13泳道检测到，说明在试验后对照的条带3代表了微生物富集，而太阳热处理使该微生物的数量减少，条带4在13～16泳道亮度明显增加，说明太阳热处理使条带4所代表的物种数量明显增加。

A，0～10 cm处的土壤样品；B，10～20 cm处的土壤样品；1～4，试验前对照的土壤样品；5～8，试验前太阳热处理区的土壤样品；9～12，试验后对照的土壤样品；13～16，试验后太阳热处理区的土壤样品；M，2 000 DNA marker。A， Soil samples at 0-10 cm; B， Soil samples at 10-20 cm; 1-4， Soil samples in the control zone before experiment; 5-8， Soil samples in the treatment zone before experiment; 9-12， Soil samples in the control zone after experiment; 13-16， Soil samples in the treatment zone after experiment; M， 2 000 DNA marker.图7 细菌16S rDNA PCR扩增产物凝胶电泳图Fig.7 The agarose gel electrophoresis of the PCR amplification product of bacteria 16S rDNA

1～4，试验前对照的土壤样品；5～8，试验前太阳热处理区的土壤样品；9～12，试验后对照的土壤样品；13～16，试验后太阳热处理区的土壤样品；A，土壤0～10 cm处细菌微生物DGGE图谱；B，使用Image-Lab对A图进行数字化处理；C，土壤10～20 cm处细菌微生物DGGE图谱；D，使用Image-Lab对C图进行数字化处理。1-4， Soil samples in the control zone before experiment; 5-8， Soil samples in the treatment zone before experiment; 9-12， Soil samples in the control zone after experiment; 13-16， Soil samples in the treatment zone after experiment; A， DGGE profiles of bacterial at 0-10 cm; B， Digitized Fig. A with the Image-Lab; C， DGGE profiles of bacterial at 10-20 cm; D， Digitized Fig. C with the Image-Lab.图8 土壤细菌DGGE图谱Fig.8 DGGE profiles of soil bacteria

2.5.3 土壤细菌微生物多样性的影响

土壤细菌微生物的香浓维纳指数如表2。试验前，太阳热处理区B和非太阳热处理区A 0～10 cm处土壤细菌群落的香浓维纳指数分别为1.55、1.51，10～20 cm处土壤细菌微生物群落的香浓指数为0.83、0.91。试验后，土壤0～10 cm处A区和B区细菌微生物的香浓维纳指数分别为1.61、1.98，10～20 cm处A区和B区细菌微生物的香浓维纳指数分别为1.19、1.53。结果表明，试验前后A区不同深度的土壤细菌微生物多样性无明显变化；而在B区，不同深度的土壤微生物多样性均明显提高，其中0～10 cm处和10～20 cm处土壤微生物多样性分别提高了31%和68%。

表2 土壤细菌香浓维纳多样性指数Table 2 Shannon-Wiener index of soil bacteria

同列数据后没有相同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。
The values with different letters in the same column represented significant differences (P<0.05).

2.5.4 DGGE条带回收测序结果

优势条带序列及与GenBank数据库的比较结果如表3，结果表明，土壤中所检测的条带大部分为未培养的细菌，且测序的条带与已发表的序列相似度均达到95%以上。

表3 DGGE胶中回收条带序列分析结果Table 3 The comparative results of DGGE bands recovered with the sequence from GenBank

3 结论与讨论

Matheron等[22]研究发现，太阳热处理可以通过改变土壤理化环境以影响活性根肿菌休眠孢子的数量并降低根肿病发病率。本研究结果表明，太阳热处理使土壤在10 cm和20 cm处的温度升高4.1 ℃和3.7 ℃，虽然不同深度土壤的温度均得到提高，但幅度较小，不过温度累计时间却明显不同：在土壤10 cm处，太阳热处理区B的高于30 ℃、35 ℃和40 ℃累计时间与非太阳热处理区A相比明显增加。推测太阳热处理区B温度提高幅度较小是由于研究期间试验区平均气温低于往年(仅27 ℃)，且半月以上为多云天气而导致(数据来自天气预报)。

研究表明[23]，低pH土壤更容易发生根肿病，其最适发病率的pH值为4.5～5.5，将土壤pH值调节至6.5以上可有效减轻根肿病的发生情况。本研究供试土壤试验前的pH值为4.76～5.02，呈弱酸性，太阳热处理使0～10 cm处土壤的pH值比试验前提高了0.64，在10～20 cm处提高了0.76。

根肿病的发病率和病情指数与根肿菌休眠孢子的浓度和活性呈明显正相关，Gilardi等[24]认为，土壤太阳热处理主要通过提高土壤温度，直接杀死土壤中的病原菌或降低土壤微生物的活性，性，从而达到抑制土壤染病的目的。龙同等[25]认为，根肿菌休眠孢子在1×103mL-1以上时均能侵染白菜，而且随着休眠孢子数量的增加感染率逐渐升高。本研究结果显示，太阳热处理使土壤中根肿菌休眠孢子的数量明显降低，但风干的土壤中根肿菌休眠孢子的数量仍达到5×105g-1以上，该浓度依旧会导致根肿病的发生。因此，如何将根肿菌休眠孢子的浓度降低至不可使植物受到侵染还有待进一步研究。

目前，土壤微生物多样性已成为评价土壤健康的重要指标之一[26]，苗则彦等[27]研究表明，病原菌侵染植物后通过改变其生理代谢导致分泌物成分和含量的变化，从而造成健康植株和非健康植株根际微生物种类及数量的区别；刘琴等[28]实验结果表明，受侵染土壤微生物功能的多样性明显低于健康土壤。目前普遍认为太阳热处理主要通过提高土壤的温度而改变土壤微生物群落的结构[29-31]。PCR-DGGE技术是研究土壤中可培养和不可培养微生物的重要方法[32]，本文利用PCR-DGGE技术研究太阳热处理对土壤细菌微生物多样性的影响，结果显示：在太阳热处理区B不同深度土壤的细菌微生物多样性均明显提高，其中0～10 cm处和10～20 cm处土壤微生物多样性分别提高了31%和68%，该结论与Smalla等[33]和Rumberger等[34]研究结果相似，提高土壤细菌微生物的多样性能够缓解土壤根肿病发病情况。

云南省嵩明县是十字花科蔬菜根肿病的高发区，本研究对该地区根肿病发病严重的菜地进行太阳热处理，提高土壤的温度，升高土壤的pH值，提高土壤细菌微生物的多样性，使根肿病的发病率和病情指数均得到降低。后续可将太阳热处理与有机改良土壤或生物防治等技术相结合，对土壤理化性质、根际土壤的微生物群落结构、土壤氮磷含量、EC值及土壤酶类有所调节，以效果明显且绿色环保的方式降低根肿病发病率及病情指数。因此，太阳热处理在根肿病的防治方面具有广阔的研究前景和应用价值。