受体光漂白FRET技术的实践与优化

刘双双，王 君，尹 伟，娄绘芳

（1.浙江大学 医学院公共技术平台，浙江 杭州 310058；2.浙江大学 浙江大学校医院，浙江 杭州 310058）

蛋白质间的相互作用是细胞各种基本功能的主要完成者，对生命活动的调节具有重要意义。许多经典的生物化学方法用于阐明这种相互作用，如免疫共沉淀、酵母双杂交等，但这些方法却无法检测细胞中发生的较弱或瞬态相互作用。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术克服了光学分辨率的限制，能够精确检测蛋白质间的相互作用。具体是指当这两个荧光基团间的距离小于10 nm 时，基团之间的能量通过偶极-偶极耦合作用，以非辐射方式从供体传递给受体的现象。所以FRET 技术适合研究几纳米内相邻两个分子之间的相互作用[1]。

利用显微镜建立的FRET 技术的4 种方法为光谱成像法、受体光漂白法、敏化发射法和荧光寿命法。其中受体光漂白法不受光渗透的影响，可重复性高，是建立FRET 技术的常用方法[2-3]。但此方法对图像采集和漂白效率具有严格的要求，只有通过优化设置，才能检测到蛋白质之间微弱的相互作用。本文利用Olympus FV1000 共聚焦显微镜介绍受体光漂白法FRET 技术的实现方式及优化方法，并详细阐述了图像展示和数据分析的具体方法。

1 FRET 荧光对的选择

理想的FRET 体系需要样本标记一对荧光基团，这对荧光基团通常称为供体-受体荧光对，需同时满足以下条件：①供体荧光团的发射光谱与受体荧光团的激发光谱具有重叠（＞30%）且供体的激发波长对受体无影响。②供体和受体的荧光团彼此紧密相邻（通常为1～10 nm）。③供体和受体的偶极子电极方向大致平行[4-5]。

由荧光团和传感域组成的FRET 生物传感器广泛用来监测邻近分子的变化。根据两个荧光团是否连接到同一分子上，将FRET 生物传感器分为两大类：①分子内类型，供体和受体荧光团与同一分子相连，分子中构象变化诱导产生FRET 现象，可用来检测细胞内Ca2+、cAMP 活性和激酶活性。②分子间类型，供体和受体荧光团融合到不同的分子上，当两个分子非常接近时产生FRET 现象，如检测受体的寡聚化。选择高性能的生物传感器是建立FRET 体系的关键[6-7]。

FRET 生物传感器中的荧光团主要有3 种类型：荧光蛋白、小型有机染料和量子点（QDs）。目前，遗传编码的荧光蛋白是高分辨率成像的最佳选择之一，已有多种基因改造的荧光蛋白用做FRET 荧光对，通过转染或者病毒感染的方式进入到体内或体外细胞，通过显微镜检测FRET 效率，应用较多的有ECFP-EYFP、GFP-RFP 等[8]。但荧光蛋白发射光谱的半高宽为60 nm，甚至超过100 nm，容易产生受体和供体无法分离的重叠现象。因此，荧光蛋白的光谱分布限制了其应用。相比之下，许多合成染料的发射光谱半高宽度为30～40 nm，在测量受体荧光时，供体的串色干扰较少。尤其是红色激发染料（如CY3-CY5）不仅具有更高的光子记数，而且时间寿命长，在生物研究中同样具有较高的应用价值。但是染料在没有抗体帮助的情况下，不具有标记感应域的能力。量子点可用于标记膜成分以检查质膜外部的现象，这些探针无法穿透膜，因此在检测细胞内结构（如核、线粒体、高尔基体）中很少使用[9]。

设计实验时，选择荧光对的主要标准是Förster半径r0，是指发生50% FRET 效率时荧光对的特征距离，根据供体-受体的光谱和偶极子定向参数计算得出，其范围约为3～8 nm。FRET 效率随着Förster 半径、光谱重叠、供体的量子产率、受体的消光系数增加而增大。此外还受到水溶性、抗干扰能力等方面的影响。表1 列出了常用FRET 对的特性[5]。除了待测样本标记符合要求的荧光对外，还需要设定严格的阳性对照和阴性对照，以确保显微镜系统的稳定性。

表1 常用FRET 对及其特性

2 受体光漂白FRET 技术的建立

受体光漂白法是由发生FRET 现象时，抑制供体发射荧光的事实建立起来的方法。对受体进行光漂白，能量转移受到抑制，供体的荧光信号增强[1]。通过检测供体荧光的增强计算FRET 效率。本文以供体为CFP、受体为YFP 的荧光对为例，利用Olympus FV1000 共聚焦显微镜建立FRET 技术，操作流程和步骤如图1 所示。

2.1 设置图像采集参数

采集图像的原则是在保证图像质量的基础上，尽量减少采集时间。在FV10-ASW 软件主界面下，从染料库（dyelist）里选择荧光对，设置荧光光路。通过focus X2 或者focus X4 预扫描图像，适当调节激光通过率，光电倍增管电压值HV 和增益offset 等参数，使图像达到最佳信噪比状态。为了得到高质量图像，可通过“Ctrl+H”快捷键切换到HiLo 模式，查看图像信号强度，信号过强或过弱都无法得到理想结果。

2.2 设置光刺激参数

刺激参数是否合适是FRET 技术成败的关键。设置流程如下：打开“刺激（Stimulation）”窗口，选择主扫描器，设置刺激区域为目标细胞内画出的感兴趣区域，刺激速度为10 μs/pix、刺激光透过率为80%～ 100%。选择刺激程序（Activation in Series），通过“采 集—刺激—刺激后采集”的方式实现受体漂白程序，设置刺激前采集图像3～5 张，刺激时间3～10 s。

图1 光漂白FRET 技术实验设计流程图

完整的FRET 图像采集需要使用共聚焦显微镜的时间序列扫描功能，在时间序列扫描时，设置时间间隔及获取的图像张数。其方法如下：在软件主界面下，点击“Image Acquisition”下面的“Time”按钮进行时间序列扫描，设置图像采集帧数20 张，时间间隔为“Freedom”。然后点击“Capture”按钮运行上述程序。软件将会按照“刺激前采集图像3～5 张—光刺激3～ 10 s—刺激后采集图像15～17 张”的程序运行，结束后点击“Series Done”按钮获得FRET 序列图像。

3 受体光漂白FRET 技术的优化

为了得到真实可靠的数据，获取FRET 图像时需要注意以下几点：首先，受体发生光漂白的同时不会降低供体荧光强度；其次，受体漂白后荧光值达到初始值的10%；最后，受体和供体的荧光信号不宜过强或过弱。如果图像采集或者光刺激设置不当，将检测不到FRET 现象，导致实验失败。经过大量的实验和探索，通过在以下方面进行优化，建立了一套稳定实用的方法。

3.1 图像采集优化措施

图像采集时优化方式：①采集图像时，扫描速度尽量快以减少长时间照射对供体的光漂白，所以扫描尺寸设为512×512 pix，扫描速度为2 μs/pix。②供体的激发光能量尽量低，激光设置在5%以内，以减少采集图像过程中供体发生的光漂白现象。③为防止受体漂白后供体荧光值达到饱和，采集图像时，供体的在荧光强度保持在1 000～2 000 范围内最佳。受体YFP荧光强度在2 000～4 000 范围内最佳，在这个范围内进行光刺激后，如有FRET 现象，供体的荧光增强将更加明显。④选择数值孔径较大的物镜。物镜对于图像的分辨率具有较大的影响，不同物镜的数值孔径不一致，光子汇聚能力也不一样。数值孔径大的物镜，受体的漂白效率高，供体信号增强也更明显。⑤适当增大针孔，每个镜头对应的针孔大小不一致，但都有一个最佳推荐值，建议将针孔增大到推荐值的2 倍及以上，增大针孔后，对应的供体和受体的荧光信号增强。为了达到合适的荧光强度，需要降低供体和受体激发光的透过率，不仅可减少随时间变化产生的供体光漂白，而且可增加待测样品z轴的荧光信息（即增加采样厚度），使FRET 现象更加明显。

3.2 受体光刺激优化措施

受体光刺激时优化方式如下：①配合物镜，选择充分发挥物镜分辨率的ZOOM 值扫描图像，不仅可以增加图像分辨率，还可以在同样的刺激时间内增加受体漂白效率。以60XO（60 倍油镜）为例，ZOOM 值推荐为2。②为防止供体荧光受刺激光的影响，应选择适当的刺激光能量，既不产生过漂白（漂白效率达100%）也不会使漂白效率太低。如发生过漂白，供体容易受到刺激光的影响，信号变弱；如漂白效率过低，供体的信号变化也不明显。漂白效率达90%为佳。③受体光漂白FRET 技术适合用于固定细胞样品，由于强激光能量对活细胞具有高毒性，同时活细胞容易发生漂白后恢复现象，所以不适合在活细胞中应用。

4 图像展示和分析

FRET 现象通过显微图像或者FRET 效率进行展示。FRET 效率E是指能量从供体转移到受体的百分比，与蛋白间距离的关系满足式（1）。其中r是供体和受体偶极之间的距离，r0是Förster 半径[10-11]。

4.1 FRET 图像展示

待测样本进行受体光漂白后，如有FRET 现象发生，供体不再发生能量转移，图像上表现出受体荧光明显增强的现象。HECK293 细胞共同转染CFF 和YFP质粒（表示为CFP+YFP），CFP 和YFP 分别表达在细胞内的不同位置，因距离较远，受体光漂白后，供体荧光信号没有明显增加（见图2），无FRET 现象产生，通常作为阴性对照。HECK293 细胞转染由CFP 和YFP 组成的构建体（表示为CFP-YFP），因CFP 和YFP紧密连在一起，符合共振能量转移的条件，在受体感兴趣区域漂白后供体的荧光强度明显增强（见图3），产生FRET 现象，通常作为阳性对照。图2(a)和3(a)分别为共转染和构建体转染受体漂白后供体的荧光图像，图2(b)和3(b)分别为共转染和构建体转染光漂白受体感兴趣区域，图2(c)和3(c)分别为共转染和构建体转染受体光漂白后供体的伪彩色图像，供体荧光强度增强的现象在伪彩色图像中更加明显。

图2 CFP 和YFP 共转染受体光漂白FRET 图像

图3 CFP-YFP 构建体转染受体光漂白FRET 图像

4.2 计算FRET 效率

通过量化受体漂白前后供体荧光强度的变化计算FRET 效率E，即E=1-(Ipre/Ipost)，其中Ipre和Ipost分别是光漂白前后供体的荧光强度。这是一种非常典型的方法，不依赖于图像采集参数的变化，也不依赖供体和受体量子产率和光谱渗透的干扰，因此不需要校正[12]。HECK293 细胞共转染CFP 和YFP 后测得的FRET 效率为0.035，转染CFP-YFP 构建体后测得的FRET 效率为0.208（见图4）。

图4 FRET 效率计算结果

FRET 效率计算可通过 ImageJ、cellSense 和Metamorph 等图像处理软件实现。以下为利用ImageJ软件测量FRET 效率的具体实现方法。

（1）测量供体通道中背景荧光强度：用ImageJ 选择工具选择无细胞信号的背景区域并测量荧光强度。

（2）去掉供体通道中的背景：在Process 菜单下选择Math-Subtract，减去第一步中得到的背景荧光强度。

（3）测量漂白前后供体感兴趣区域（ROI）的荧光强度：用ImageJ 选择工具选择供体内感兴趣区域，即受体所对应的光漂白区域；利用ImagJ 的插件Time Series Analyzer 测量光漂白前后供体ROI 内荧光强度的变化。

（4）计算FRET 效率：漂白后供体荧光强度减去漂白前供体荧光强度；然后用漂白后荧光强度做归一化处理，得到FRET 效率；最后从多个ROI 区域得到不同的FRET 效率后，求出平均值。

（5）作为对照，选择细胞内没有漂白区域的同样大小的ROI，测量荧光强度。设置多个对照区域的ROI，求出FRET 效率平均值。

（6）评价漂白区域是否有FRET 现象产生：当FRET 现象发生时，得到的FRET 效率结果在10%～ 40%。

5 结语

1946 年，荧光共振能量转移理论首次被Theodor Förster 阐明，所以也称Förster 能量转移，20 世纪80年代，FRET 技术成功运用到蛋白质结构的研究中。在过去十年中，由于显微镜技术的发展和优化的荧光蛋白及其衍生物的增加，FRET 技术已在生物大分子相互作用、核酸结构功能检测、免疫分析等方面具有广泛的应用[13-15]。

利用显微镜建立FRET 技术有多种方法，其中受体光漂白法仅需要目标样本，不需要大量的校准样本，其统计结果可重复性高，方法简单可靠，应用广泛。主要缺点是光漂白具有破坏性，每个细胞只能使用一次，光漂白是一个相对缓慢的过程，通常需要几秒钟或更长时间，活细胞漂白后容易发生荧光恢复现象，因此较少应用于活细胞动态测量实验。此外，如果受体-供体荧光对的偶极子电极方向不同或它们不位于Förster 半径内，则FRET 效率明显降低。例如，如果两个标记的蛋白质发生了相互作用，但荧光标签位于复合物的对立面，则可能无法检测到FRET 现象。在实际操作中，这种假阴性现象经常发生[16]。所以，在检测到足够可靠的FRET 信号之前，需要进行多种标记策略，多次实验重复。