花生栽培种InDel有效标记筛选与评估

刘 宇 闫彩霞 李春娟 徐洪明 孔 青 孙全喜王 娟 单世华

(1山东省花生研究所,山东 青岛 266100;2中国海洋大学食品科学与工程学院,山东 青岛 266000;3东阿县农业技术推广站,山东 聊城 252200)

花生是一年生草本植物,作为我国重要的油料作物和经济作物之一,是优质植物油和植物蛋白的重要来源[1-2]。其中,花生栽培种(Arachis hypogaeaL.)为异源四倍体(2n=4x=40,AABB)[3],与野生种(Arachisspp.)相比,其低水平的遗传变异与有限的种质资源[4-5]限制了栽培种花生育种的研究与发展。虽然传统育种获得较大突破,但仍存在育种效率低、周期长的缺点。为了加快育种进程、缩短育种时间,以分子标记辅助育种为核心的育种体系,成为分子育种的重要研究内容。近年来,测序技术的快速发展使得新一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)向低成本、高通量的方向发展[6],其中以测序技术为基础的分子标记技术得到了迅猛发展。目前所开发的分子标记有上万个,但在花生中仅有14.5%的分子标记显示具有多态性,可用于构建遗传图谱的分子标记只有6.4%[7]。开发新的花生分子标记已成为当前研究的重要一环。

插入/缺失多态性(insertion-deletion,InDel)作为结构变异(structure variants,SVs)的重要组成部分广泛的存在于基因组中,其分布密度仅次于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)[8],且在一些农作物中InDel 标记的多态性高于简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记[9]。与SNP 标记相比,InDel 标记设计与检测更简单[10]。同时,InDel标记作为一种新型的共显性分子标记,兼具各类遗传标记优点,具有开发成本低、准确性高、变异稳定、易于分型等优点[11]。此外,同样长度的2 个InDel 变异不可能出现在同一个基因组位点上[12]。

目前基于全基因组水平开发的InDel 标记已广泛应用于水稻[13]、沙梨[14]、油菜[15]、黄瓜[16]、葡萄[17]、棉花[18]等植物研究领域。季高翔等[19]基于棉花重测序数据开发了新标记,将矮化基因AS98 重新定位于D12 染色体InDel 50 和InDel 83 标记之间,物理间距45 kb。Chung 等[20]基于345 份玉米基因组重测序获得1 973 746 个独立的InDel 位点,这些InDel 位点多位于基因编码区,利用100 对引物对4 份玉米材料进行鉴定,获得了89 个多态性引物。但在花生全基因组水平上开发和应用的 InDel 标记相对较少,Vishwakarma 等[21]基于花生全基因水平上开发出515 223 个InDels,并用长度大于50 bp 的InDel 位点设计5 698 对引物,利用其中214 个InDel 引物筛选出86 对多态性引物。本研究基于王娟等[22]简化的花生基因组测序(reduced-representation genome sequencing,RRGS)结果,增加测试深度与广度,筛选InDel 位点,选取遗传背景较大的覆盖4 个植物学类型的花生种质进行InDel 标记的有效性检验,并评估其在花生研究中的应用潜力,以期丰富可用于栽培种花生的分子标记,为InDel 标记在栽培种花生优异基因挖掘、基因精细定位、遗传多样性分析等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取21 份遗传背景差异较大的4 个植物学类型的花生种质作为检测引物有效性材料,其中普通型6份、龙生型5 份、珍珠豆型7 份、多粒型3 份(表1)。每份种质选取2 粒完整饱满种子,于培养皿中避光浸种3～4 d,待芽长至2～4 cm 后置于光照培养箱(温度25℃,光照强度12 000 Lux)培养10 ～13 d,取幼嫩新叶。

表1 21 份花生种质信息表Table 1 Information of 21 peanut germplasms

1.2 InDel 位点筛选与引物设计

基于简化基因组测序结果,利用Mircosoft Office Excel 2010 筛选出插入/缺失碱基数为3 ～12 bp 的InDel 位点。基于花生栽培种基因组序列,将筛选出的位点定位在基因组上,于InDel 位点两翼各200 bp 长度内进行引物设计。引物设计使用Primer 6.0,上游设计范围为1～200 bp,下游设计范围为213 ～401 bp,产物大小在150～350 bp 之间,退火温度50～60℃。引物序列由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.3 DNA 提取

采用植物基因组DP305-2 DNA 提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取材料花生的DNA,P100/P100+ Nanodrop-超微量分光光度计(Pultton,美国)检测基因组DNA 质量与浓度,浓度稀释至20 ng·μL-1。

1.4 PCR 扩增和电泳分析

25 μL PCR 反应体系:2 × EasyTaq PCR SuperMix(+dye)12.5 μL、DNA 模板0.5 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,ddH2O 补足至25 μL。PCR 反应程序:95℃预变性5 min,94℃变性50 s,60℃退火1 min,72℃延伸50 s,34 个循环;72℃延伸7 min,4℃条件保存。

6%非变性聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)电泳,电压100 Ⅴ,电泳2 ～3 h。银染显色(参照张军等[23]的银染方法),拍照保存。

1.5 数据分析

根据引物对21 份花生种质的扩增结果进行记录,有带记为1,无带记为0,缺失记为-,并使用A、B、C、D等大写字母记录基因型。利用POPGENE 软件计算Shannon 指数、等位基因数、有效等位基因数。根据公式计算多态性信息量(polymorphism information content,PIC),即PIC=1-∑(xi)2,其中xi表示InDel位点第i个等位基因的相对频率。

2 结果与分析

2.1 InDel 标记的鉴定

通过筛选获得插入/缺失为3 ～12 bp 的InDel 位点共39 个,根据其位置信息设计39 对InDel 标记引物。由表2 可知,13 号染色体有6 个位点,12 号染色体有4 个位点,其余染色体位点较少。此外,有11 个位点位于外显子区域,18 个位点位于内含子区域,5′端非翻译区7 个位点,3′端非翻译区3 个位点。由此可推测,栽培种花生基因组中的InDel 变异多位于非编码序列。

表2 本研究筛选的39 个InDel 标记信息Table 2 The information of the 39 InDel markers screened in this study

表2(续)

2.2 InDel 标记有效性检验

以21 份花生种质基因组DNA 为模板,采用PCR方法检验39 对引物的有效性。39 对引物均能扩增出清晰、均一的条带,条带大小与预测产物大小基本相同。经统计获得多态性引物14 对,占总设计引物数的35.9%。其中,引物InDel-28 扩增结果变异最为丰富,获得5 种不同类型的条带(图1-A);引物InDel-19扩增获得3 种类型条带,但仅有2 份种质出现变异(图1-B);InDel-23 引物扩增获得2 种类型条带,变异较为丰富(图1-C)。

图1 3 个InDel 标记多态性检测结果Fig.1 The polymorphism detection results of 3 InDel primers

2.3 InDel 标记在鉴定种质资源和特异性中的应用及其功能评价

利用软件POPGENE 1.32 对14 对多态性引物在21 份花生种质中的扩增结果进行分析。由表3 可知,14 对引物共检测出36 个等位基因,等位基因数为2 ～5 个,平均每个标记2.571 4 个。有效等位基因数介于1.099 8～3.073 2 之间,平均值为1.630 2。其中InDel-28 位点检测到的等位基因数最多,为5 个;8 个InDels 位点只检测到2 个等位基因;5 个InDels 位点检测到3 个等位基因。Shannon 指数分布在0.191 4 ～1.295 1 之间,平均值为0.579 4,其中,InDel-36 标记Shannon 指数最低。PIC 介于0.090 7 ～0.674 6 之间,平均值为0.349 6,其变化趋势与Shannon 指数一致,其中InDel-28 标记PIC 最高,而InDel-36 标记的PIC最低。

14 个InDel 标记中有3 个标记位于基因编码区域,其中重要的2 个标记:InDel-04 标记与CCCH 型锌指蛋白转录因子有关,InDel-11 标记与bHLH 130 转录因子有关,这2 个基因均会影响到花生的抗逆性,标记可用于育种选择。11 个InDel 标记位于基因的非编码区域,其中InDel-23 和InDel-24 标记均与花生的抗叶锈病有关;InDel-28、InDel-29、InDel-36 标记分别影响细胞色素P450、驱动蛋白NACK1 以及半乳糖醛酸转移酶的功能。

综上,开发的14 个InDel 标记可用于遗传多样性分析、遗传图谱的构建、农艺性状的QTL 定位和育种性状选择。

表3 基于14 个InDel 标记的多态性信息Table 3 The polymorphism information based on 14 InDel markers

3 讨论

DNA 分子标记多态性水平的高低通常作为评估其应用潜力的标准之一。本研究成功检测到14 对具备多态性的InDel 引物,多态率达35.9%,PIC 介于0.090 7～0.674 6 之间。王亮等[24]从225 对AFLP 引物中筛选出42 对多态性引物,多态率为18.6%;刘阳杰等[25]用12 对SSR 引物与48 对InDel 引物扩增77份美国花生种质,分别获得4 对多态性SSR 引物(多态率33.3%)和15 对多态性InDel 引物(多态率31.3%);Vishwakarma 等[21]利用4 份不同植物学类型的花生种质对214 个InDel 标记进行多态性筛选,获得86 个多态性标记,多态率达40.2%;Liu 等[26]从功能基因的保守序列中开发出48 个InDel 标记,对6 个不同植物学类型的118 份栽培种花生筛选,获得16 个多态性InDel 标记,多态率为33.3%,且PIC 为0.017～0.660;Meng 等[27]利用4 个植物学类型的54 份花生种质对48 个InDel 引物进行筛选,其中24 对引物具有多态性,多态率高达50.0%,PIC 为0.036 4～0.903 0。上述研究的分子标记的多态率分布于18.6%～50.0%之间。通常评估分子标记的多态性水平的精确性与用于标记筛选的种质数量和种质之间的系谱差异有较大关系。与上述报道相比,本研究筛选获得的InDel 标记处于中等多态性水平,可能是因为本研究仅选用了筛选的21 份花生种质。但本研究所选用种质材料覆盖了4 种植物学类型和代表性种植区域,这种遗传背景差异大的花生种质具有较强的代表性,由此筛选的InDel 标记能够为花生种质遗传多样性分析提供重要参考。

目前,虽然已开发出大量的分子标记,但只有较少的重要性状如抗线虫病[28]和高油酸[29]等被应用到花生分子标记辅助育种进程中,还有较多如抗锈病、晚叶斑病以及青枯病[30-31]等重要性状尚处于开发状态。本研究筛选获得的InDel 标记中有2 个重要标记位于基因的编码区域:InDel-04 标记与CCCH 型锌指蛋白的功能有关,该类型的锌指蛋白不仅在植物发育与胁迫反应中起重要的调控作用,而且对次生壁的形成以及花药的发育产生影响[32];InDel-11 标记与bHLH130 转录因子有关,该类型转录因子在植物的生长发育以及非生物胁迫响应方面至关重要。Guang等[33]研究发现棉花中bHLH130 基因表达受干旱、低温的诱导,可能作为调控基因参与逆境应答过程。同样,在花生的非编码区中也获得了多个重要标记,其中InDel-23 标记、InDel-24 标记分别与抗叶锈类Lr10 激酶、Lr10 抗病基因位点蛋白激酶受体有关,对植物的抗叶锈能力起到关键作用;标记InDeI-28 会影响花生中细胞色素P450 的合成,并且细胞色素P450 与植物的次生代谢的合成与解毒有着密切关系。有报道指出,在除草剂苯达松及甲磺隆诱导下,与细胞色素P450 合成相关的CYP81A6 基因会过量表达[34]。综上,本研究筛选获得的14 个InDel 标记,尤其是位于基因编码区的InDel-04、InDel-11 标记,可为后续的功能标记开发提供重要参考。InDel 标记作为一种较新的遗传标记,其相关的生物学功能和意义需要逐渐探索与挖掘,并通过进一步的验证分析,使其能够尽早应用到分子标记辅助育种进程中。

4 结论

本研究成功筛选得到14 个多态性InDel 标记,这些标记具有较高的遗传多样性。其中3 个多态性标记位于基因编码区,尤其是InDel-04、InDel-11 标记均与花生抗逆性相关,且在基因的非编码区同样发现了多个标记与花生重要性状相关。本研究不仅丰富了用于栽培种花生的InDel 标记,而且这些InDel 标记可为后续功能验证以及进一步开展栽培种花生种质资源鉴定提供有效工具。但这些标记尚需通过实时荧光定量PCR 检测(real-time fluorescence quantitative PCR)和基因编辑等分子生物学技术进行进一步的功能鉴定和验证。