不同土壤水分含量对丹参生长及4种水溶性有效成分含量的影响

刘晓蕾, 高明

(1.宁夏回族自治区农业学校, 银川 750021; 2.宁夏葡萄酒与防沙治沙职业技术学院, 银川 750021)

丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)作为我国的传统大宗药材，其有效成分主要包括脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的丹酚酸类化合物。目前，对于丹参的研究主要集中在栽培模式[1]、栽培技术[2]、有效成分积累[3-4]、临床研究[5-7]等方面。

国内外对丹参脂溶性成分已进行了大量研究[8-9]，而我国中医传统用药多以水煎服，即以丹参的水溶性成分入药为主，其药理作用广泛，具有多种活性[10]。丹参水溶性有效成分更容易制作成注射液,在治疗心脑血管疾病、恶性肿瘤等疾病方面表现突出[11-13]。目前对于丹参水溶性成分研究多集中在测定方法[14]、提取工艺[15]等方面，同一种药用植物在不同生长时期、不同环境下，其次生代谢物含量处于动态变化中[16]。土壤是植株赖以生存的基质，土壤水分的多少决定着植物成活与否、长势好坏，对于根类药材更与其有效成分的积累有着密切关系，严重水分胁迫和水分过多都不利于菘蓝中靛玉红积累，中度水分胁迫能促进根部靛玉红积累[17]。水分胁迫促进短葶飞蓬中药用成分灯盏乙素和咖啡酸酯的积累[18]。但是，关于不同土壤水分下、不同生长时期丹参水溶性有效成分积累规律方面的报道较少。掌握药材有效成分积累的动态变化规律，是确定药材最佳采收期的前提。因此，本研究采用盆栽法控制土壤水分，监测不同土壤水分下丹参的生长指标，应用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定不同土壤水分含量、不同生长时期根部丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B的含量变化，拟阐明丹参水溶性有效成分的积累规律，揭示4种成分的最佳土壤水分条件和采收期，为宁夏等干旱地区丹参的规范化栽培、质量“稳定、可控”提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料和试剂

试验用苗期的丹参幼苗(约180 d)，来自陕西商洛天士力药源基地。

甲醇(色谱纯和分析纯)、乙腈(色谱纯)、磷酸(色谱纯)购自西安化学试剂厂。丹参素钠、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B标准品均购自中国食品药品检验研究院。

1.2 试验方法

试验采用盆栽法。将试验地耕层土壤与蚯蚓粪、细河沙按3∶1∶1混匀，每桶装入10 kg，桶尺寸：高27 cm、上口径35 cm、下口径22 cm。于2018年3月选取大小一致、无病，根部粗细均匀、健壮的幼苗移栽于塑料桶中，每桶3株，共40桶。采用环刀法测定此盆栽土田间最大持水量(θf)为27%。盆栽桶放置于宁夏农业学校大棚内。缓苗生长1个月，待幼苗长势稳定后，选取大小、长势相近的幼苗30桶，设35%θf、55%θf、75%θf3个土壤水分梯度，每个处理重复10桶。不浇水，让其自然耗至设定水分后，通过电子秤(皇鹰，HY-998)每天称重浇水，控制土壤水分持续保持在设定梯度水平。

1.2.1丹参生长指标的观察测定 于5月15日—6月15日，每5 d测量株高、叶长一次，利用毫米刻度尺测量基部到主茎顶部之间的距离作为株高，用毫米刻度尺测量幼苗叶基到叶尖的长度作为叶长。

1.2.2丹参水溶性有效成分含量测定 于5月—10月每隔20 d进行间隔性采样，挖取丹参地下根部分，60 ℃烘干粉碎过40目筛。保存于阴凉通风处，备用。准确称取丹参地下部样品粉末每份0.050 g，每个处理3个重复，加入5 mL 70%甲醇摇匀，室温下浸泡7 h，100%功率超声45 min，常温10 000 r·min-1离心5 min ，取上清液经0.45 μm 滤膜过滤得供试品溶液。

分别精密称取干燥的水溶性对照品丹参素钠1.18 mg、咖啡酸1 mg、迷迭香酸0.30 mg、丹酚酸B 5.98 mg，置于10 mL棕色量瓶中，75%甲醇溶解后定容，质量浓度分别为118、100、30、598 μg·mL-1，分别吸取不同体积的丹参素钠、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B标准品溶液，以75%甲醇稀释为10个不同质量浓度的系列溶液。按下述色谱条件进行测定，以标准品的质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，进行回归分析，所得标准曲线回归方程如下：丹参素钠的回归方程为y=2 198 091.829 3x-23 594.047 5,R2=0.999 9；咖啡酸的回归方程为y=5 403 851.047 6x-42 127.033 2，R2=0.999 0；迷迭香酸的回归方程为y=3 492 217.069 4x-134 249.412 9，R2=0.998 9；丹酚酸B的回归方程为y=1 200 681.000 9x-81 160.019 4，R2=0.999 3。

色谱柱：Waters Sunfire-C18(5 μm，4.6 μm×250 mm)；柱温：30 ℃。流动相：乙腈(B)-0.02%磷酸水溶液(A)；检测波长：全波长扫描，丹参素钠、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B的检测波长依次为281、325、331、288 nm。水-乙腈梯度洗脱系统见表1。

表1 指纹图谱的流动相梯度Table 1 Linearity of mobile system of fingerprints

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 16.0软件对原始数据进行统计分析，采用LSD法进行差异显著性多重比较检验。

2 结果与分析

2.1 不同土壤水分含量对丹参株高和叶长的影响

土壤水分不足时，植株各茎节间活动受抑，伸长迟缓，株高降低，叶的长度减小以减弱蒸腾失水[19]。从不同水分处理的丹参生长状况(图1)可以看出，随着时间的延长，丹参的株高和叶长均表现出逐渐上升趋势，符合植物生长的一般规律。3种水分处理下，株高和叶长均呈现75%θf>55%θf>35%θf的趋势，这与贺少轩等[20]在2种酸枣中的研究结果一致。说明在5—6月期间，丹参地上部分的生长与土壤水分成正比，土壤水分充盈利于地上部分生长。

图1 不同水分处理对丹参株高和叶长的影响Fig.1 Effects of different treatments on stem height and leaves length of S. miltiorrhiza

2.2 不同土壤水分含量对丹参根部丹参素含量的影响

5—10月整个测定期内3种土壤水分处理的丹参根系中水溶性丹参素积累的动态结果(图2)表明，3种水分梯度下，丹参素在整个测定期内均在6月28日丹参素含量最高，随后含量逐渐下降；9月18日出现第二峰点，但丹参素含量低于6月28日的值。从5月到8月中旬，丹参素含量一直表现为55%θf处理的最高，且与另2个处理差异极显著(P<0.01)，总体表现为55%θf>35%θf>75%θf；从8月28日开始，其含量与土壤水分成反比，35%θf处理最高，且与另2个处理差异极显著(P<0.01)，表现为35%θf>55%θf>75%θf。综上说明，6月下旬是丹参素积累量最高的时期，其次是9月中旬。同时，丹参素积累的土壤适宜水分随丹参生长时期而变，9月之前，土壤水分控制在55%θf较适宜丹参素的积累，而进入9月后，土壤水分应控制在35%θf。

图2 不同水分处理对丹参素含量的影响Fig.2 Effects of different treatments on Danshensu content in roots of S. miltiorrhiza

2.3 不同土壤水分对丹参根部咖啡酸含量的影响

3种土壤水分处理下丹参根系中咖啡酸积累的动态过程(图3)显示，随着水分处理时间的延长，咖啡酸一直表现为在55%θf处理含量最高，35%θf次之，75%θf的最低。除10月3日55%θf处理的结果与另2个处理显著差异外(P<0.05)，其他检测时期均表现为极显著差异(P<0.01)。在整个测定期内，3个水分处理的咖啡酸含量走势均呈“双峰型”曲线，最高点出现在6月28日，第二峰点出现在9月18日，之后3个处理的咖啡酸含量均逐渐下降。由此可知，丹参有效成分咖啡酸含量积累较高的时期为6月下旬和9月中旬，土壤水分控制在55%θf左右有利于咖啡酸的积累。

图3 不同水分处理对咖啡酸含量的影响Fig.3 Effects of different treatments on caffeic acid content in roots of S. miltiorrhiza

2.4 不同土壤水分含量对丹参根部迷迭香酸含量的影响

3种土壤水分处理下丹参根系中迷迭香酸积累的动态过程见图4，可见，在整个测定期内，3种水分梯度下，迷迭香酸含量整体呈急剧升高又缓慢降低的趋势。随着水分处理时间的延长，迷迭香酸始终显现为75%θf处理的含量最高，且与另2个处理差异极显著(P<0.01)。3个水分处理均在6月28日达到迷迭香酸含量最高点，随后逐渐降低，75%θf处理下含量在8月28日出现短暂上升后继续下降。由此可知，迷迭香酸含量积累较高的时期为6月底，土壤水分适度升高促使根部迷迭香酸在体内合成，土壤含水量为75%θf最佳。

图4 不同水分处理对迷迭香酸含量的影响Fig.4 Effects of different treatments on rosmarinci acid content in roots of S. miltiorrhiza

2.5 不同土壤水分对丹参根部丹酚酸B含量的影响

丹酚酸B具有保护心脑血管、抗肝损伤等作用[21]。3种土壤水分处理下丹参根系中丹酚酸B积累的动态过程见图5，可见， 3个水分处理下，丹酚酸B在整个测定期内呈“双峰型”曲线，6月28日丹酚酸B含量最高，随后逐渐下降，75%θf和55%θf处理在8月28日出现第2峰点，35%θf处理的第2峰点出现在9月18日；之后，3种水分控制下的丹酚酸B含量均逐渐降低。5月底到8月底期间，75%θf处理的丹酚酸B含量最高，与另2个处理差异极显著(P<0.01)；8月28日55%θf处理含量最高，与另2个处理差异极显著(P<0.01)；9月18日后35%θf处理最高，且与另2个处理差异极显著(P<0.01)。整体而言，6月下旬是丹酚酸B累积最高的时期。建议大田种植时，应根据不同生长时期来人工控制适合丹酚酸B积累的土壤水分供给，以达到适合丹酚酸B积累的最佳种植条件。

图5 不同水分处理对丹酚酸B含量的影响Fig.5 Effects of different treatments on salvianolic acid B content in roots of S. miltiorrhiza

从图2～5可知，在同一时间、同一土壤水分条件下，丹参根部的4种有效成分含量表现为：丹酚酸B>迷迭香酸>丹参素>咖啡酸。

3 讨论

整个试验期内3种水分处理下丹参根部4种水溶性有效成分的积累基本都呈“双峰型”曲线，且均在6月28日达到最大值，由此说明，6月下旬是丹参根部水溶性有效成分积累的关键时期，这与秦海燕等[21]的研究结果一致。9月中旬是4种有效成分积累的第2高峰期，随后逐渐降低，这与刘灵娣等[16]对不同时期丹酚酸B的变化趋势研究结果相同。

本研究表明，不同生长时期，丹参根部不同有效成分对水分的需求量有所不同。丹参素在9月份之前，55%θf条件下含量最高，而进入9月份之后，土壤水分应控制在35%θf左右。咖啡酸的积累在整个测定期内均为55%θf处理最佳。迷迭香酸积累在整个测定期内，均表现为75%θf水分条件最佳，说明土壤含水量适度升高利于迷迭香酸的积累。丹酚酸B在9月之前，75%θf水分条件最佳；进入9月后，35%θf水分处理最好。刘大会等[22]认为土壤水分在55%θf～60%θf条件下促进丹参苗期的丹酚酸B积累，与本研究结果有所差别，可能因为其选用丹参种子栽种，而本研究选用180 d的丹参幼苗栽种，从而导致不同生育期植株对需水量存在差异所致。

丹参素和丹酚酸B的需水规律具有相似性，均为在9月之前需水相对较多，且土壤含水量分别在55%θf和75%θf时有效成分含量最大，9月之后土壤需要保持干旱，水分含量降至35%θf最佳。可能是因为6～8月是全年高温时期，蒸腾旺盛，同时也是丹参生长的旺盛时期，植株维持代谢活动需水量相对较大；进入9月，气温下降，空气湿度逐渐增大，植物蒸腾作用减弱，35%θf的水分含量已能够满足丹参生长代谢需要，控制土壤水分保持相对干旱，能使其与外界的湿润气候产生综合效应，从而达到积累有效成分的目的，而9月之后，两个土壤水分含量较高的处理可能对植物造成了涝害胁迫，影响其正常生长生理代谢，次生代谢物积累缓慢。

综上所述，土壤水分亏缺抑制丹参生长，丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量均在6月下旬达到最大值，9月中旬进入第二积累峰值，在大田种植时，可根据这2个时期灵活采收。不同土壤水分水平能够影响丹参水溶性有效成分的积累，土壤湿润利于丹酚酸B和迷迭香酸合成，土壤适度干旱促使咖啡酸和丹参素合成。但在丹参的不同生长时期、不同有效成分对水分的需求量又有差异。4种有效成分对水分的需求量表现为：丹参素<咖啡酸<丹酚酸B<迷迭香酸。在对干旱地区丹参规范化种植管理时，应根据栽培的目标成分不同，结合生长期，制定合理的水分管理措施，保证药材质量稳定、可控。