滇重楼种质资源抗旱综合评价及生理机制研究

李纪潮, 张金渝, 杨天梅, 杨美权, 杨维泽, 许宗亮, 左应梅

(云南省农业科学院药用植物研究所, 昆明 650231)

滇重楼[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz]即云南重楼，百合科重楼属(Paris)，分布于云南境内及接壤的部分地区，药用价值较高。滇重楼为高原阴生植物，种子有双重休眠特性，休眠期长，需经过两冬一夏才能完成形态学和生理学后熟，部分种子在休眠期遭遇不良环境会丧失发芽活力[1]。

滇重楼野外生长居多，自然生境中，水分胁迫是种子休眠萌发的重要成因，导致种胚发育缓慢、胚根突破种子困难等诸多不利因素，种源抗旱性鉴定是全生育期抗旱性鉴定的重要环节[2]。王士强等[3]对小麦抗旱研究表明,生理性状比农艺性状对干旱胁迫更敏感，水分胁迫下细胞通过信号感知转导，调节基因表达造成大量的生理和代谢的变化[4]，引起氧化胁迫和活性氧(reactive oxygen species, ROS)积累[5]，形成有毒产物，如丙二醛(malondialdehyde, MDA)。而植物通过调节超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)来清除过多的ROS，维持体内氧化还原平衡[6]。抗氧化酶系统的表达量和抗氧化物质的积累量与水分胁迫的耐抗性呈正相关[7]。目前，滇重楼种子的生理变化也有少许研究，包括不同层积条件[8]、萌发阶段[9-10]、高温胁迫[11]对滇重楼种子生理变化的影响，但关于水分胁迫的研究还未见报道。根据前人研究结果[12]，本文设置正常水分和水分胁迫两种处理，测定可溶性蛋白(soluble protein，SP)、抗氧化酶及MDA含量，研究水分胁迫对滇重楼种质资源生理活动的影响，揭示各种源材料对水分环境的适应性，综合评价最优的抗旱资源和筛选抗旱鉴定生理指标，以期为滇重楼抗旱机理研究和抗旱新品种选育提供理论和基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2018年10月滇重楼种子收获季节，分别到云南滇重楼分布主产区采种，包括临沧市云县、临沧市耿马县、曲靖市师宗县、文山州文山市、大理州鹤庆县、昆明市石林县6个种源地。种子经云南省农业科学院药用植物研究所鉴定为滇重楼，具体地理资源分布见表1。

表1 不同种源滇重楼地理位置及气候概况Table 1 Geographic location and climate data of different provenances of Parispolyphylla var. Yunnanensis

1.2 试验方法

将采集的滇重楼种子去除红色种皮，挑选饱满大小一致的种子，于100 mg·L-1多菌灵(高效低毒广谱性杀菌剂，防治多种真菌病害)中浸泡2 h，蒸馏水冲洗5遍，晾干水分。将灭菌过的湿沙放入培养皿中，种子间隔1 cm均匀分布，共4层，每层60粒。每个培养皿均按此操作，每个处理设置3个重复。将所有种质材料放置于两个湿度处理的人工智能气候箱中，湿度设置分别为10%(正常水分处理，CK)和3%(水分胁迫处理，T)，培养条件昼/夜温度为25 ℃/20 ℃，分别于处理后10、30、60 d，随机采集20粒种子待测。

1.3 测定项目及方法

待测酶液的提取：各处理滇重楼种子用液氮磨成粉末，取1 g的3份样，分别加入0.1 mol·L-1浓度的1 mL H3PO4缓冲液(pH 8.0)，研磨成匀浆，倒入离心管定容到10 mL，置于4 ℃超低温离心机4 000 r·min-1离心20 min，取上清液即为待测酶液。

可溶性蛋白(SP)含量测定采用考马斯亮蓝法[13]，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑还原法[14]，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法测定[15]，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚显色法[13]，丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸加热比色法测定[13]。

1.4 计算方法

1.4.1抗旱系数 据各生理指标数据计算对照和水分胁迫处理的平均值，根据公式(1)计算滇重楼各种质材料的每个生理指标的抗旱系数(drought coefficient，DC)，再根据公式(2)计算各生理指标的综合抗旱系数(comprehensive drought coefficient，CDC)。

DC= 胁迫处理测定值/对照测定值×100%

(1)

(2)

式中，胁迫处理测定值和对照测定值分别表示各种质材料在胁迫处理(T)和正常水分处理(CK)下各生理指标的酶活性测定值；CDC表示不同种质资源间5个生理指标抗旱系数的平均值。

1.4.2权重 所有生理指标中的权重系数计算公式如下。

(3)

式中，Wi表示第i个生理指标的贡献率在所有生理指标的累计贡献率中的比值；Pi表示SPSS主成分分析中第i个生理指标贡献率，用来表征第i个指标在所有指标中的重要程度。

1.4.3隶属函数值 应用Fuzzy数学中隶属函数法综合评判不同种质材料的抗逆性，相关的参数SP、CAT、SOD、POD采用隶属函数公式(4)计算，与抗逆性成负相关的参数MDA采用反隶属函公式(5)计算。

u(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(4)

u(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(5)

式中，Xi为所有测定的生理指标中第i个指标测定值；Xmin、Xmax分别表示所有种质材料测定的生理指标中第i个指标的最小值、最大值。

1.4.4抗旱性度量值 抗旱性度量值D计算公式如下。

(6)

式中，u(Xi)表示各种质材料中第i个生理指标的隶属函数值；Wi表示第i个生理指标的权重系数；D表示各种质材料的抗旱性度量值，以D进行排序，评价各种质材料抗旱性强弱。

1.4.5权重系数及加权抗旱系数 以各资源抗旱性度量值D作为参考序列，各生理指标的DC作为比较序列，进行灰色关联度分析，得到各生理指标的关联度(γD)，据公式(7)获得各生理指标的权重系数ωi(γ)，按公式(8)计算出加权抗旱系数WDC。根据D、CDC和WDC对各资源进行系统聚类分析，再以各生理指标的DC为比较序列，WDC为参考序列，进行灰色关联度分析得到关联度(γWDC)，分析各生理指标的重要排序。

(7)

(8)

式中，γi表示第i个生理指标的关联度；ωi(γ)表示第i个生理指标的关联度在所有生理指标的累积关联度中的比值；DC表示各种质材料的抗旱系数；WDC表示各种质材料加权抗旱系数。

1.4.6抗旱性模型预测 分别以各资源的D、CDC和WDC作为因变量，对各生理指标的DC进行逐步回归分析，并进行相关性分析，得到D、CDC和WDC两两的相关系数。

1.5 数据处理

运用SPSS 20.0进行配对样本数据t检验、频率分析、相关性分析、主成分分析、系统类聚分析[16]，用Excel 2017软件进行数据整理并制表。

2 结果与分析

2.1 水分胁迫对滇重楼种子生理活性的影响

2.1.1滇重楼种质资源生理指标及抗旱系数的差异分析 表2显示，6个种源地滇重楼种子的各生理指标对水分胁迫响应的变化不一致，随胁迫时间延长，SP呈先下降后回升的趋势，而SOD和CAT酶活性呈先升高后降低的趋势，MDA和POD呈逐渐降低趋势。水分胁迫对生理活性的影响较为显著，根据表2对照和水分胁迫处理的t检验显示，水分胁迫后，10 d时，MDA和SOD受到极显著影响(P<0.01)，胁迫和对照间达极显著水平差异(P<0.01)，CAT受到显著影响(P<0.05)；在30 d时，SOD和POD受到极显著影响(P<0.01)，SP、MDA和CAT均受到显著影响(P<0.05)；在60 d时，CAT受到极显著影响(P<0.01)。滇重楼种质资源之间变异系数较大，对干旱胁迫的敏感性不同，其中各生理指标变异系数介于2.2%～63.4%之间，滇重楼种源在60 d水分胁迫下MDA含量变异系数高达59.6%，其次是CAT酶活性，变异系数较高；各种源的抗旱系数的变异系数在2.1%～40.3%之间，在30 d时可溶性蛋白含量变异系数最大，其次是CAT酶活性。据处理和对照的相关系数分析显示，在10 d时，SP和POD的水分胁迫处理和对照间呈极显著相关(P<0.01)，MDA处理和对照间呈显著相关(P<0.05)；60 d时，MDA处理和对照间呈极显著相关(P<0.01)，SP和SOD的处理和对照间呈显著相关(P<0.05)。

表2 不同处理下各生理指标的均值及抗旱系数的差异分析Table 2 Variation analysis of the mean value and drought resistance coefficient of physiological indexes under different treatments

2.1.2滇重楼种质资源生理指标的抗旱系数频率分布 据表3中各生理指标DC的连续频率次数统计显示，在同一区间内各生理指标DC分布的次数和频率存在一定差异。在0.2≤DC<0.4区间，CAT酶活性频率最高为36.1%，对干旱胁迫最为敏感；在0.4≤DC<0.6区间，MDA的频率最高，达到36.1%，CAT次之；在0.6≤DC<0.8区间，MDA和SOD分布频率较高，分别为47.2%和50.0%；在0.8≤DC≤1.0区间，SP和POD分布频率较高，分别为86.1%和77.8%。综合分析表明，各生理指标对干旱胁迫反应的敏感程度依次为：CAT>MDA>SOD>POD>SP。

表3 各指标抗旱系数在不同区间的分布Table 3 Distribution of DC of each index in different interval

2.2 滇重楼种质资源的各生理指标相关性及主成分分析

对各生理指标进行Person相关系数分析，并采用Duncan新复极差法进行双侧显著性检验，相关性分析结果(表4)显示，SP与SOD和POD呈显著负相关(P<0.05)，表明随SP含量的降低，SOD和POD酶活性升高；而其他各生理指标间无显著相关。据主成分分析结果(表5)显示，根据特征值>1和主成分载荷矩阵，提取前3个主成分因子，其贡献率分别为41.48%、23.56%、20.01%，累积贡献率达85.04%。把原先的5个生理指标转换为3个新的相互独立的综合指标(用 F1、F2 和 F3 表示)，第一主成分F1中SOD的载荷系数最大，第二主成分F2中CAT的载荷系数最大，第三主成分F3中MDA的载荷系数最大，表明SOD、CAT和MDA可作为滇重楼种质资源抗旱评价中的主成分生理指标。

表4 各生理指标相关性Table 4 Correlation of physiological indexes

表5 各生理指标的主成分分析结果Table 5 Principal component analysis results of physiological indexes

2.3 滇重楼种质资源综合抗旱评价

表6显示，滇重楼各种质资源D在0.036～0.153之间，均值为0.091，其变异系数为18.6%；通过抗旱性度量值D大小对滇重楼种源进行抗旱排序：文山种源抗旱性最强，鹤庆和石林地域次之，临沧市的2个种源地云县和耿马排名最后，抗旱性较弱。另外，各种质资源CDC介于0.585～0.795之间，变异系数为4.3%；根据CDC大小排序，师宗抗旱性最强，文山和鹤庆次之，耿马抗旱性最弱。其次，各种质资源WDC介于0.111～0.157之间，变异系数为5.0%；WCD与CDC的抗旱性排序结果相同，师宗抗旱性最强，耿马抗旱性最弱。对D、CDC和WDC进行系统聚类分析，结果(图1)显示，师宗、鹤庆和石林聚为一类，抗旱性最强；文山和云县单独聚为一类，抗旱性次之；耿马单独聚为一类，抗旱性最弱。

图1 各种质资源抗旱评价系统聚类分析Fig.1 Clustering of drought assessment systems for resources

表6 各种质资源抗旱性评价的D、CDC 和WDCTable 6 D, CDC and WDC for drought resistance evaluation of various quality resources

2.4 抗旱生理指标筛选

据表7的关联度γD、权重系数ωi和关联度γWDC显示，各生理指标与D的密切程度排序依次为：CAT>MDA>SOD>POD>SP。γWDC是各生理指标与各种质资源的抗旱性的关联度，各生理指标与WDC的密切排序依次为：CAT>MDA>SOD>POD>SP。据表8逐步回归显示，D、WDC和CDC的回归方程，F检验达到极显著水平，说明模型拟合度较好，回归方程有较好的解释能力，能较优评价滇重楼生理指标的抗旱性。V3(SOD)、V5(CAT)和V2(MDA)为3个回归方程的因子变量，表明SOD、CAT和MDA能有效鉴定滇重楼种质资源的抗旱性。同时，通过对D、WDC和CDC之间相关性分析可得，其两两之间均为显著正相关，WDC和CDC之间呈极显著正相关。综合分析可得，CAT、MDA、SOD能有效鉴定滇重楼种质资源的抗旱性，可作为滇重楼抗旱鉴定的生理指标。

表7 各生理指标DC与D和WDC的关联度及位次Table 7 Correlation degree and rank of DC and D and WDC of physiological indexes

表8 各种质资源抗旱性模型预测和不同综合评价指标间的相关性Table 8 Correlation between drought resistance model prediction and different comprehensive evaluation indexes of quality resources

3 讨论

水分胁迫破坏细胞内的稳态环境，对膜质产生过氧化反应和脱酯化反应，发生生理劣变[17]，可使种子失去活力和发芽力，难以萌发，具体反映在ROS水平、脂质过氧化副产物的含量、清除酶的过量表达和渗透调节物的积累等方面[18]。

3.1 滇重楼抗旱性种质资源的评价筛选

滇重楼喜阴湿、水分适中的环境。段宝忠等[19]研究表明，湿度是影响滇重楼生长分布的最主要限制因子；石子为等[20]研究表明，降雨量是滇重楼潜在分布的主导气候因子。本研究中，不同地域资源对干旱胁迫的敏感性不同，水分胁迫下各种质资源间变异系数差异较大，在MDA含量和CAT酶活性上表现出较高的变异系数。陈中苏直等[21]研究表明，滇重楼具有较高的遗传多样性，居群间具有一定的遗传分化。

另外，本研究通过D、CDC和WDC进行系统聚类，结果显示，师宗、鹤庆和石林抗旱性最强，耿马单独聚为一类，抗旱性最弱。对3份强抗旱资源的来源地进行气候分析，滇重楼抗旱种质资源分布于降水量较少的滇中和滇东南地区。与李玲等[16]研究结果一致，这是种质资源长期在干旱环境下自然选择的结果。杨莉等[22]研究显示，植物体内的酶是DNA编码遗传信息表达的结果，其与环境和激素的相互作用及对环境变化的适应性有关，环境差异是决定氧化酶活性改变的重要因素。同时，植物的抗旱性是由遗传因子和环境共同控制的一个复杂数量性状，本研究对滇重楼抗旱资源进行评价，筛选出强抗旱资源，可为引种驯化、抗旱基因发掘、抗旱品种选育提供理论依据。

3.2 滇重楼种质资源的抗旱生理指标鉴定筛选

植物抗旱性是一系列生理生化代谢调控途径的相互作用，不同生理指标对干旱的响应也各不相同，在抗旱性鉴定过程中，指标性状的选择尤为重要。本研究中，不同评价方法对滇重楼抗旱生理指标筛选的结果较为一致。其中，据抗旱系数分布频率显示，CAT对水分胁迫最为敏感，SOD和MDA次之；同时，采用D和WDC进行灰色关联分析，与王焱等[23]研究结果相同，各生理指标关联度γD和γWDC基本一致，依次为CAT>MDA>SOD；另外，据D、WDC和CDC的回归方程分析，CAT、SOD和MDA为3个回归方程的因子变量，能有效鉴定滇重楼种质资源的抗旱性。CAT、MDA、SOD可作为滇重楼资源抗旱鉴定的生理指标，这与吴永波等[24]的研究结果一致，SOD酶活性受土壤水分影响极其显著。孙建等[25]研究显示，芝麻抗旱品种表现为SOD和CAT保护酶活性的差异；张翠梅等[26]研究发现，MDA可作为苜蓿品种干旱评价指标。

Bashri等[27]和Bose等[28]研究表明，SOD作为ROS防御系统的第一条防线，在膜保护酶系统中是最有效的抗氧化酶之一，其活力水平的高低可以反映植物对逆境抗性能力的大小；CAT作为第二道防线，其活性的变化规律在一定程度上可以反映对胁迫的耐受程度和种子萌发活力大小。Pawowska等[29]研究表明，MDA作为膜脂过氧化作用的指标，可反映植物遭受胁迫的损伤程度及对胁迫反应的强弱，抗旱能力强的植物受旱后，其MDA含量增幅较小。本研究结果表明，CAT、SOD和MDA可作为滇重楼种质资源的抗旱性指标，可有效提高鉴定工作效率，也可为其他植物的抗旱性鉴定提供参考。

据相关性分析显示，SP与SOD和POD呈显著负相关。胁迫使膜质过氧化加剧，产生代谢ROS通过氧化还原修饰改变关键调节蛋白酶的功能来影响可溶性蛋白代谢关键酶的基因表达，使其含量锐减[30]，渗透调节能力降低，导致Ca2+流入细胞质，直接或间接激活ROS信号转导网络中的关键节点RBOH，使ROS信号与多种信号转导途径相链接，形成ROS波[31]，进一步调节胁迫反应基因表达，使抗氧化酶活跃持续升高[32]。

3.3 滇重楼抗旱性分析方法的选择

干旱胁迫下植物生理生化代谢涉及面较广，前人研究主要集中在生理渗透调节和保护酶活性两方面，评价种质资源的抗旱性除了需要选择适宜的评价指标，还需有合适的评价方法[16]。前人对资源的抗旱性评价，较多以权重和隶属函数方法为主，而忽略各生理指标对干旱胁迫反应的响应程度。本研究结合王兴荣等[33]的抗旱性综合评价方法，并进行配对样本T检验对比水分胁迫与对照的差异，探究各生理指标对水分胁迫的敏感程度。对于生理指标的抗旱评价不仅用频次分析和主成分分析来评价生理指标的权重，还结合隶属函数评价法、相关分析法得到D，并以各生理指标抗旱系数DC为基础，采用抗旱性度量值D、综合抗旱系数CDC和加权抗旱系数WDC，结合灰色关联分析得到各生理性状DC与D的关联度(γD)，并对各生理指标的DC进行逐步回归分析，对滇重楼抗旱生理指标进行系统的综合评价，减除各生理指标因单位的不同造成的影响，还结合生理指标变异系数以评价各种质资源的差异及各生理指标在抗旱性评价中的重要程度。因D和WDC既考虑了各生理指标的相关性，又考虑了各生理指标的权重，故以抗旱性度量值D为综合评价指标，并以加权抗旱系数WDC为辅助抗旱评价的指标，更能全面精确区分种质资源的抗旱性强弱，确保抗旱评价结果的可靠性[33-34]。