高尔基磷酸化蛋白3在胆囊癌组织中表达的临床意义及其与血管生成的关系

李福利，夏咸军，刘洪，方征，赵海滨，罗昆仑

（中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院 1.肝胆外科 2.病理科，江苏 无锡 214044）

胆囊癌是一种恶性程度极高的胆道系统恶性肿瘤，其病情隐匿，预后极差，严重威胁患者生命健康，其发生、发展是多基因、多步骤病理信号转导的复杂过程，其中，癌基因的激活为该过程中重要环节之一[1-2]。靶向治疗是近年来的研究热点，但目前有效的胆囊癌靶向药物极少，因此迫切需要寻找胆囊癌治疗的新靶点[3-4]。高尔基磷酸化蛋白3（GOLPH3）是近年来研究发现的新癌基因，其能通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路促进肿瘤的发生、发展[5-6]。另外，血管生成是肿瘤生长、增殖及转移的先决条件，血管内皮生长因子（VEGF）是一种高度特异的血管内皮生长因子，通过诱导血管新生，它在肿瘤的生长、浸润过程中发挥重要作用[7-8]。微血管密度（MVD）计数对评价血管生成具有重要意义[9]。目前关于GOLPH3在胆囊癌中的表达及其与肿瘤血管形成的关系国内外未见报导，本研究通过检测胆囊癌标本中GOLPH3、VEGF的表达及MVD计数，探讨它们与胆囊癌临床病理特征及预后的关系，为胆囊癌的临床治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集联勤保障部队第九0四医院2010年1月—2018年12月手术切除的胆囊癌标本80例，其中男24例，女56例；年龄36～87岁，平均年龄63.4岁。术前均未行放化疗且病例资料完整。按照美国癌症联合委员会2010病理分期标准，I期患者6例，II期10例，III期35例，IV期29例；有淋巴结转移46例，无淋巴结转移34例；肿瘤高分化14例，中分化29例，低分化37例；组织类型分类：腺癌72例，腺鳞癌8例。对照组为我院同期手术切除的30例慢性胆囊炎标本。本研究经医院伦理委员会批准实施。

1.2 免疫组化检测GOLPH3、VEGF的表达及MVD

组织石蜡包埋后切片，切片厚约4 μm，应用免疫组织化学SP法染色检测GOLPH3（GOLPH3单克隆抗体购自Abcam公司，工作浓度1:400）与VEGF（VEGF单克隆抗购自Abcam公司，工作浓度1:100）的表达及CD34（CD34单克隆抗购自Abcam公司，工作浓度1:200）标记的MVD（其他试剂及设备均由我院病理科提供）。以已知阳性组织切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

GOLPH3主要表达于细胞质及部分细胞核，VEGF主要表达于细胞质，由2名高年资病理科医师进行切片观察，均以细胞质染色为判定阳性细胞指标，参照Simons[10]评分标准，采用半定量法，随机计数5个高倍镜视野，根据阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱分别计分。根据阳性细胞百分比＜1%、1%～30%、31%～75%、＞75%分别定为0、1、2、3分，根据阳性细胞染色强弱定为：无着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。两项相加0～2分为阴性（-），≥3分为阳性（+）。MVD测定标准：以血管内皮细胞呈棕黄色染色作为阳性标准，参照Weidner等[9]的评分标准，将被CD34染成棕黄色的单个内皮细胞、细胞团或与其不相连的分枝结构作为一个微血管计数，先在低倍镜下选择5个血管密度最高区域，然后在高倍镜下（×200）计数每个视野微血管数，取其均数作为该标本的MVD值。

1.4 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本均数比较采用t检验，多组样本均数比较采用方差分析；计数资料采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法并绘制生存曲线，并进行Log-rank检验，相关分析采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GOLPH3、VEGF表达及MVD检测结果

GOLPH3主要表达于细胞质及部分细胞核，VEGF主要表达于细胞质，CD34标记的MVD主要见于血管内皮细胞（图1）。GOLPH3在胆囊癌组织中的阳性表达率明显高于慢性胆囊炎组织（χ2=28.476，P＜0.05）；VEGF在胆囊癌组织中的阳性表达率明显高于慢性胆囊炎组织（χ2=29.220，P＜0.05）；80例胆囊癌标本MVD平均值为47.36±13.08，30例慢性胆囊炎标本MVD平均值为26.97±7.31，差异有统计学意义（t=8.066，P＜0.05）（表1）。

2.2 GOLPH3、VEGF表达及MVD计数与胆囊癌患者临床病理特征的关系

分析结果显示，GOLPH3的阳性表达率与患者癌组织的分化程度、有无淋巴结转移、TNM分期明显有关（均P＜0.05），而与患者的性别、年龄、组织类型无关（均P＞0.05）；VEGF阳性表达率与患者的性别、年龄、组织类型、分化程度无关（均P＞0.05），而与癌组织有无淋巴结转移、TNM分期有关(P＜0.05)。MVD计数与胆囊癌的分化程度、有无淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05），而与患者的性别、年龄、组织类型无关（均P＞0.05）（表2）。

图1 免疫组化检测GOLPH3、VEGF表达与MVD计数（×200，标尺：300 μm）Figure 1 Immunohistochemical staining for GOLPH3 and VEGF expressions and MVD counts (×200, bar: 300 μm)

表1 两种组织中GOLPH3、VEGF表达及MVD计数的比较Table 1 Comparison of the expressions of GOLPH3 and VEGF and MVD counts between the types of tissues

表2 GOLPH3、VEGF表达及MVD计数与胆囊癌患者临床病理特征的关系[n（%）]Table 2 Relations of GOLPH3 and VEGF expressions and MVD count with the clinicopathologic variables of the gallbladder carcinoma patients [n (%)]

2.3 胆囊癌组织中OLPH3、VEGF表达与MVD计数的相关性

Spearman等级相关分析结果显示，GOLPH3与VEGF在80例胆囊癌中的表达呈正相关（r=0.437，P＜0.05）（表3）。在80例胆囊癌患者中，GOLPH3阳性者MVD平均值为51.45±13.78，GOLPH3阴性者MVD平均值为40.17±7.71，随着GOLPH3表达增高，胆囊癌组织中MVD也增加，两者呈正相关（r=0.416，P=0.000）（表4）；VEGF阳性者MVD平均值为50.54±13.09，VEGF阴性者MVD平均值为38.43±8.08，随着VEGF表达增高，胆囊癌组织中MVD也增加，两者呈正相关（r=0.433，P=0.000）（表5）。

表3 GOLPH3与VEGF在胆囊癌组织中表达的相关性分析关系Table 3 Correlation analysis between GOLPH3 and VEGF expressions in gallbladder carcinoma tissue

表4 GOLPH3表达与MVD计数在胆囊癌组织中的相关性分析关系Table 4 Correlation analysis between GOLPH3 expression and MVD count in gallbladder carcinoma tissue

表5 VEGF表达与MVD计数在胆囊癌组织中的相关性分析关系Table 5 Correlation analysis between VEGF expression and MVD count in gallbladder carcinoma tissue

2.4 GOLPH3、VEGF与MVD与胆囊癌患者预后的关系

行电话、信件方式随访胆囊癌患者的生存情况，随访截止日期为2019年7月，全组随访时间1～46个月，中位随访时间10个月，其中71例患者死亡，9例患者至随访时间结束仍存活。Kaplan-Meier生存分析显示：GOLPH3阳性组中位生存时间为8个月，GOLPH3阴性组中位生存时间为12个月，两者比较，差异有统计学意义（χ2=5.3 0 0，P=0.021）（图2A）；VEGF阳性组中位生存时间为8个月，VEGF阴性组中位生存时间为17个月，两者比较，差异有统计学意义（χ2=6.0 2 3，P=0.014）（图2B）。以80例胆囊癌标本MVD的均数为界，将患者分为高MVD组与低MVD组，高MVD组中位生存时间为6个月，低MVD组中位生存时间为15个月，两者比较，差异有统计学意义（χ2=11.986，P=0.001）（图2C）。

图2 不同特征胆囊癌患者生存曲线 A：GOLPH3阳性与阴性表达患者；B：VEGF阳性及阴性表达患者；C：高MVD计数与低MVD计数癌患Figure 2 Survival curves of gallbladder cancer patients with different characteristics A: Patients with positive and negative GOLPH3 expressions; B: Patients with positive and negative VEGF expressions; C: Patients with high MVD count and low MVD count

3 讨 论

GOLPH3是一种分子量大小约34 000的高尔基体复合物相关蛋白，是反面高尔基体网状结构（TGN）家族的一员，它最初是从大鼠肝高尔基体蛋白质组学分析中被发现的，并且在蛋白质加工、受体回收和糖基化过程中发挥重要作用[11-12]。GOLPH3基因位于人染色体5p13上，该染色体区域与多种肿瘤的发生相关[13]，最近研究显示GOLPH3通过刺激mTOR通路、提高蛋白激酶B（Akt）活性及减低转录因子FOXO1转录活性促进肿瘤细胞的生长、增殖，可能是一种新的癌基因[14]。GOLPH3通过介导多种糖基化蛋白酶的定位功能促进肿瘤相关蛋白的分泌，有利于癌细胞的侵袭与转移[15]。此外，Wen等[16]的研究显示，敲除GOLPH3基因不仅能够抑制肿瘤细胞株增殖，促进其凋亡，还可以通过调节上皮-间充质转化（EMT）抑制肿瘤细胞的侵袭及转移，反之，GOLPH3的过表达促进细胞株的增殖与迁移。目前GOLPH3在多种肿瘤如肺癌[17]、胃癌[14]等的表达研究已有相关报导。本研究首次证明GOLPH3在胆囊癌组织高表达，并且GOLPH3的阳性表达与胆囊癌的分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移有关，说明GOLPH3在胆囊癌的发生、发展、侵袭与转移过程中同样起重要作用。另外，有研究[18-20]显示GOLPH3的高表达也影响肿瘤的预后。本研究中也显示，GOLPH3与胆囊癌的不良预后相关，提示GOLPH3蛋白的表达情况可以作为胆囊癌不良预后的预测因素。

血管生成与肿瘤的生长与转移密切相关，介导肿瘤血管生成的因子众多，其中最重要因子是VEGF，VEGF通过与内皮细胞膜上的特异性受体VEGFR结合，启动一系列细胞内信号传导从而提高血管通透性、促进血管内皮细胞的增殖及血管新生[7]。李洪波等[21]通过检测胆囊癌组织与胆囊息肉组织中VEGF蛋白的表达发现胆囊癌组织中VEGF表达率远高于胆囊息肉组，本研究中，胆囊癌组织中VEGF蛋白表达也远高于慢性胆囊炎组，这与上述报导一致。另外，本研究中VEGF的阳性表达还与胆囊癌的TNM分期、有无淋巴结转移有关，这与赵敏等[22]的研究结果基本一致。此外，肿瘤的生长越快，所需血流灌注所提供的营养越多，新生血管生成就越多，血管密度越大[23]。因此，通过检测肿瘤组织MVD的表达，对指导肿瘤患者的进一步治疗具有重要意义。关于肿瘤MVD的研究国内外均屡有报导[24-27]。本研究中使用CD34标记血管内皮细胞测量胆囊癌组织的MVD，结果MVD不仅在胆囊癌组织中高表达，并与其不良预后相关。这与国内白涛等[28]的研究一致。

mTOR信号通路在调节人体肿瘤细胞增殖、分化及转移过程中发挥重要作用[29-30]。有研究[31]显示mTOR信号通路的活化可以上调缺氧诱导因子1a（HIF-1a）的表达促进VEGF表达，进而刺激内皮细胞增殖，诱导血管新生增加肿瘤血供。GOLPH3通过mTOR复合物mTORC1和mTORC2底物磷酸化或丝氨酸磷酸化位点（Ser473）磷酸化激活AKT直接或间接激活磷酸肌醇三激酶（PI3K）/Akt/mTOR信号通路[5]，有可能参与肿瘤血管生成。本研究结果显示胆囊癌组织中GOLPH3与VEGF表达呈正相关，并且GOLPH3与VEGF均与胆囊癌MVD呈正相关，随着胆囊癌的发展GOLPH3与VEGF表达增高，相应的肿瘤MVD也增加。提示GOLPH3有可能通过诱导VEGF表达共同促进胆囊癌的血管形成及其发生发展，但具体机制仍需要进一步的分子生物学研究。

综上所述，GOLPH3与VEGF的表达与胆囊癌的发生、发展及血管形成密切相关，通过对它们在胆囊癌中表达的研究，为进一步揭示胆囊癌的发生、发展机制提供了一个理论基础。此外，本研究中，GOLPH3、VEGF与MVD均与患者的不良预后相关，因此，监测它们在胆囊癌组织的表达水平有助于判断患者的预后。通过抑制GOLPH3或VEGF在胆囊癌中的表达，减少肿瘤血管形成，有可能阻止或延缓胆囊癌的发生、发展，改善患者不良预后，本研究也为胆囊癌的靶向治疗提供了一个新思路。