肝脏激酶B1低表达与肿瘤患者不良预后关系再评价的Meta分析

廖东旭，杨冲，郑波，杨雪婷

（四川省医学科学院/四川省人民医院 1.肝胆外一科 2.器官移植中心 3.急诊科，四川 成都 610072）

近年来，肿瘤已成为全世界人类死亡的主要原因之一。据统计，2018年全球共有1 810万例新发癌症病例和960万例癌症死亡病例，其中肺癌最常被诊断出的癌症（占总病例的11.6%），也是导致癌症死亡的主要原因（占总癌症死亡人数的18.4%）[1]。手术切除仍被认为是大多数早期癌症的主要疗法，而近几十年来，虽然诊断和治疗技术取得了令人鼓舞的进展，然而不幸的是，晚期癌症仍然预后不良。一些临床指标，如组织学分级、病理分型、淋巴结转移和其他临床病理指标，常被用来评估肿瘤的预后。但是，这些指标均不能视为独立的预测指标。因此，继续寻找新的标志物可能为肿瘤的预后预测提供帮助。

人类肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）或丝氨酸-苏氨酸激酶11（serine/threonine kinase 11，STK11）基因位于19号染色体上[2]并在多种人体组织中广泛表达，其编码的LKB1蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，这种激酶可以调节多种细胞的生理和病理过程[3]。LKB1可以直接促进AMPK以调节mTOR通路[4]。LKB1的突变可以导致其失活进而影响癌症相关的代谢，分化[5-7]以及细胞外基质重塑[8]，从而促进癌变，局部进展和转移[9]。LKB1还能够对细胞极性和细胞完整性产生影响[10].细胞极性的破坏表明上皮-间质转化（EMT）和癌症进展[11-12]。因此，LKB1目前被认为是许多癌症类型中的关键癌症抑制基因[13]。最新一项研究表明盐诱导激酶（salt-inducible kinases，SIK）对于限制肿瘤发展至关重要，而LKB1和SIK缺陷型肿瘤之间的组织学和基因表达高度相似，这表明LKB1和SIK构成肿瘤抑制轴从而抑制肿瘤进展[14-15]。另一项研究发现LKB1可以抑制调节性T细胞（Treg）和Th17细胞,进而调节树突状细胞的代谢，充当其关键信号枢纽,增强正常的免疫稳态和抗肿瘤能力[16]。LKB1抑制肿瘤进展的机制极为复杂，需要更进一步的研究。

LKB1的低表达与大多数肿瘤的预后不良有关，但也有少数肿瘤类型文章观点相互矛盾[17-18]。在某些特定条件下，LKB1可能是癌症的起始因子[10]。笔者在先前的Meta分析以及最近3年发表了几项新研究中发现了一些有争议的问题[19]，因此笔者进行了最新的Meta分析，以评估LKB1表达在癌症患者中的预后价值。

1 资料与方法

按照系统评价和Meta分析的最佳报告声明（PRISMA）的指导进行研究的系统评价和Meta分析[20]。因为Meta分析收集了以前的研究结果并进行了分析，所以未申请伦理审批。

1.1 纳入与排除标准

1.1.1 纳入标准 ⑴ 回顾性队列研究/病例对照研究；⑵ 研究与LKB1表达和癌症预后的关系有关；⑶ 通过免疫组织化学、蛋白质印迹、基因测序、分子分析等方法测定LKB1蛋白的表达水平或基因拷贝数；⑷ 文献中包含足够有效的数据来评估生存结果，包括危险比（HR）、相对比（RR）或优势比（OR）以及相应的整体生存率（OS）95%置信区间（CI），无病生存率（DFS）、无进展生存率（PFS）、无复发生存率/（RFS）等；⑸ 英文文献。

1.1.2 排除标准 ⑴ 重复性文章；⑵ 阅读标题和摘要后无关的文章；⑶ 会议摘要、评论、病例报告、信函、机制研究和动物模型研究；⑷ 缺乏足够信息和数据的研究；⑸ 同一研究中心或同一作者重复发表的文献。

1.2 检索策略

在PubMed、Embase和Cochrane Library数据库中对2 0 1 8年1 2月1日前发表的相关文章进行了系统和全面的搜索。英文检索式包括：LKB1；STK11； Liver Kinase b1（all fields）； Neoplasia； Neoplasias；Neoplasm；Tumors；Tumor；Cancer； Cancers；Malignant Neoplasms；Malignant Neoplasm；Neoplasm；Malignant；Neoplasms；Malignant；Malignancy；Malignancies（all fields）；Prognosis；Prognostic；Survival；Overall Survival（all fields）。PubMed、Embase和Cochrane Library数据库由2名作者独立搜索。为了避免由于电子筛选方法而造成的遗漏，还对随附文献的参考文献进行了筛选。

1.3 资料提取及文献质量评价

根据上述纳入标准，由3位研究人员客观地提取和纯化符合条件的信息：第一作者；出版年份；地区；癌症类型；男/女；肿瘤分期；中位年龄（范围）；结局变量的HR（95%CI）；检测方式；HR来源；NOS评分；影响因素；研究类型；是否为多元分析。为避免不必要的偏差，上述所有数据都是由3位研究人员独立提取。

如果在某些文章中同时描述了单变量和多变量分析，则选择多变量分析以保证本研究的准确性。NOS（纽卡斯尔-渥太华质量评估量表）评分用于评估所选研究的质量[21]，如果一篇文章的得分为5分以上，则应将其包括在我们的研究中，且≥6分属于高质量。研究质量评估由2名研究人员实施。

1.4 统计学处理

使用STATA/SE 12.0版本（Stata Corporation，College Station，TX，USA）软件来分析和计算统计数据。合并的HR和相应的95%CI用于描述LKB1表达的预后价值；统计异质性通过Cochran Q检验和I2检验进行评估。该软件可用于计算I2和P值，如果I2＜50%或P＞0.05，则表明纳入研究中的异质性较低，应选择固定效应模型，否则，应该选择一个随机效应模型。异质性的来源可以通过亚组分析和根据相似变量的Meta回归来确定。执行敏感性分析以评估组合结果的稳健性和可靠性。由于在所研究的所有人群和亚组中，癌症的预后指标差异不大，HR、OR和RR之间的差异可以忽略不计，因此，OR和RR均被视为HR[22]。使用Begg的漏斗图和Egger检验来评估潜在的发布偏见。当P＜0.05时，表示有统计学意义。

2 结 果

2.1 纳入研究的过程及研究的特点

根据检索策略，在Pubmed、Embase和Cochrane Library数据库中共检索到1 630条记录。删除491篇重复的文献后，通过筛选标题和摘要将1 072篇无关的记录排除在外（图1）。查阅全文之后再次排除44条记录，包括缺乏必要的数据（n=23）、会议摘要（n=10）、审阅（n=3）、病例报告（n=4）或者非英语文献（n=4）。最后，剩余23条记录被保留并纳入Meta分析中[17-18,23-43]。共有4 357例来自不同国家（中国，法国，美国和韩国）的病例被纳入了这项研究，以阐明LKB1表达水平与各种肿瘤患者预后之间的关系。这些病例包含了多种肿瘤患者，包括肝细胞癌、胃癌、胰腺神经内分泌肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、神经胶质瘤，喉癌、非小细胞肺癌、胰腺导管腺癌、肺腺癌、肝内胆管癌、前列腺癌、结直肠癌或乳腺癌。在这项Meta分析中，22项研究报告了OS，12项研究报告了DFS/PFS/RFS。表1总结了与合格研究中纳入患者的主要临床病理特征。

2.2 质量评估

通过NOS评分法对纳入的23项研究进行了评估，其得分在5～8分之间，中位数为6.65分（表1）。根据NOS评分，得分为6分以上的文献属于高质量文献。因此，本Meta分析可被视为有效的方法。

图1 文献纳入流程图Figure 1 The literature screening process

表1 纳入研究的主要特征Table 1 Main characteristics of the included studies

表1 纳入研究的主要特征（续）Table 1 Main characteristics of the included studies (continue)

2.3 OS和DFS/PFS/RFS

在这项Meta分析中，采用了生存结局变量作为预后指标，即OS、DFS、PFS、RFS；由于P F S和R F S作为结局变量的研究数量有限，将DFS，RFS和PFS结合在一起作为DFS/RFS/P F S来评估预后。鉴于O S观察到统计异质性（I2=65.2%，P＜0.001），因此采取了随机效应模型的方法来计算总HR。结果表明低表达的LKB1与肿瘤不良OS之间的明显有关（合并HR=1.94，95%CI=1.55～2.43，P＜0.001）。对于DFS/PFS/RFS为结局变量的研究中心同样存在明显的异质性（I2=81.3%，P＜0.001），因此也选择了随机效应模型，结果显示，LKB1低表达与不良DFS/PFS/RFS之间明显有关（HR=1.53，95%CI=1.08～2.17，P=0.017）（图2）。综上所述，低表达的LKB1引起肿瘤患者的不良预后。

图2 各种肿瘤中LKB1低表达的HR森林图 A：OS的HR；B：DFS/RFS/PFS的HRFigure 2 Forest plots of HR for low LKB1 expression in various cancers A: HR of OS; B: HR of DFS/RF/PFS

2.4 亚组分析和Meta回归分析

由于所纳入的研究中明显存在统计学异质性，因此进行了亚组分析寻找异质性的来源，主要分析了以下几个混杂因素的影响：癌症类型、NOS评分、研究类型和影响因素。由于报告不足和临界值变化，未对其他特征进行分析以探讨异质性的来源。对于OS（图3），肝癌（HR=1.65，95%CI=0.48～5.66，P=0.428）和乳腺癌（HR=1.21，95%CI=0.14～10.80，P=0.863）在LKB1低表达与不良预后之间没有显示出明确的关系。对于DFS/RFS/PFS（图4），NOS≥7（HR=1.25、95%CI=0.55～2.83，P=0.357）、免疫组化（HR=1.40，95%CI=0.81～2.40，P=0.226）、RFS（HR=1.28，95%CI=0.32～5.14，P=0.727），DFS（HR=1.52，95%CI=0.97～2.38，P=0.066）、肝癌（HR=1.22，95%CI=0.31～4.72，P=0.775）、胰腺癌（HR=1.59、95%CI=0.29～8.63，P=0.591）和乳腺癌（HR=1.16，95%CI=0.26～5.18，P=0.846）没有显示出具有统计学意义的关系。此外，进一步行了Meta回归分析以探究异质性的来源，发现除了影响因素亚组外其余混杂因素可能不被视为异质性的来源（OS：P＜0.001，DFS/RFS/PFS：P＜0.001）（表2-3）。

图3 针对OS混杂因素不同亚组的森林图 A：癌症类型；B：NOS评分；C：研究类型；D：影响因素Figure 3 Forest plots of subgroups analyses of OS for different confounding factors A: Cancer types; B: NOS scores; C: Study types;D: Influential factors

图4 针对DFS/RFS/PFS混杂因素不同亚组的森林图 A：癌症类型；B：NOS评分；C：研究类型；D：影响因素Figure 4 Forest plots of subgroups analyses of OS for different confounding factors A: Cancer types; B: NOS scores; C: Study types;D: Influential factors

表2 LKB1表达水平的不同亚组分析的OSTable 2 Subgroups analysis of the OS of different LKB1 expression levels

表2 LKB1表达水平的不同亚组分析的OS（续）Table 2 Subgroups analysis of the OS of different LKB1 expression levels (continue)

表3 LKB1表达水平的不同亚组分析的DFS/RFS/PFSTable 3 Subgroups analysis of DFS/RFS/PFS of different LKB1 expression levels

2.5 LKB1表达水平在不同肿瘤类型的预后意义

为了评估LKB1表达水平在不同肿瘤类型的预后意义，进一步进行了亚组分析（图5）。对于胰腺癌，LKB1低表达与总生存率较差存在明显关系（HR=1.83，95%CI=1.20-2.80，P=0.005），而对于DFS/RFS/PFS则无统计学意义（P=0.591）。对于肝癌（OS：P=0.428；DFS/RFS/PFS，P=0.775）和乳腺癌（OS：P=0.863；DFS/RFS/PFS，P=0.846），均无统计学意义。肺癌（OS：HR=1.81，95%CI=1.36～2.39，P＜0.001；DFS/RFS/PFS，HR=1.78，95%CI=1.02～3.12，P=0.043）和胃肠道癌（OS：HR=2.57，95%CI=1.43～4.62，P=0.002；DFS/RFS/PFS，HR=1.89，95%CI=1.19～2.99，P=0.007）患者中LKB1的低表达均导致预后变差。在本研究中，存在几种类型的癌症，因为其只有一项研究而被定义为其他癌症，包括皮肤恶性黑色素瘤（OS：HR=3.69，95%CI=1.12～12.10）、胶质瘤（OS：HR=3.02，95%CI=1.00～6.02）、喉癌（OS：HR=1.63，95%CI=1.06～2.50）、肝内胆管癌（OS：HR=1.82，95%CI=1.40～2.38；DFS/RFS/PFS：HR=1.78，95%CI=1.36-2.35）和前列腺癌（OS：HR=3.98，95%CI=1.70～9.34）。结果表明，其他癌症的LKB1表达水平与患者的OS和DFS/RFS/PFS也密切关系（OS：HR=2.10，95%CI=1.55～2.83，P＜0.001；DFS/RFS/PFS：HR=1.78，95%CI=1.35～2.35，P＜0.001）。综上所述，LKB1的表达降低引起多种肿瘤患者较差的预后。

图5 LKB1表达水平与不同肿瘤类型的生存结果之间的关系分析 A：OS分析；B：DFS/RFS/PFS分析Figure 5 Analysis of relationship between LKB1 expression levels and survival outcomes in different types cancers A: OS analysis;B: DFS/RFS/PFS analysis

2.6 发表偏倚和敏感度分析

发表偏倚是基于OS（图6A）和DFS/RFS/PFS（图6B）做出的漏斗图，结果显示没有明显的发表偏倚。敏感度分析用于评估每个研究对汇总结果的影响。所有纳入的研究都被分别排除在外，没有一项研究对OS（图7A）和DFS/RFS/PFS（图7B）的合并HR产生明显影响。

图6 Begg漏斗图 A：OS分析；B：DFS/RFS/PFS分析Figure 6 Begg's funnel plots A: OS analysis; B: DFS/RFS/PFS analysis

图7 所有纳入LKB1表达的预后价值的敏感性分析 A：OS分析；B：DFS/RFS/PFS分析Figure 7 Sensitivity analysis of the prognostic value of LKB1 expression in all included studies A: OS analysis; B: DFS/RFS/PFS analysis

2.7 LKB1表达水平的生存分析

为了验证得到的结果，基因表达谱分析交互式分析（GEPIA）也用于分析患者的生存情况。通过分析高LKB1表达组的4 750例患者和低LKB1表达组的4 745例的生存情况，结果发现低LKB1表达导致了癌症患者的低生存率（OS：HR=1.14，P＜0.001；DFS/RFS/PFS：HR=1.09，P=0.023）（图8）。这些数据进一步证实了本研究的准确性。

图8 GEPIA数据库显示的LKB1表达水平与生存率的关系Figure 8 Relationship between LKB1 expression level and survival rate shown by GEPIA web tool

3 讨 论

本Meta分析汇总了先前的研究结果并增加了近几年的新研究，发现LKB1在多种肿瘤中表达降低并导致癌症患者预后变差。LKB1抑制肿瘤进展的机制极为复杂。LKB1-AMPK信号通路的激活也可以抑制癌细胞的合成代谢、调节细胞能量状态、上皮极性和细胞增殖来阻止癌细胞的生长[44-47]，随着LKB1-AMPK信号通路的激活，结节性硬化复合物2（TSC2）也被该通路激活，TSC2通过抑制雷帕霉素（mTOR）及其复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点引起细胞自噬[48-50]。由于缺氧是大多数癌症的重要特征[51]，LKB1可以调节和控制缺氧诱导因子1（HIF-1），以在缺氧条件下阻断癌细胞的增殖。此外，LKB1也是p53依赖性细胞凋亡的介体[52]并且可以通过激活JNK途径诱导细胞凋亡[53]。

尽管已经对LKB1进行了Meta分析和系统评估，但笔者在已发表的Meta分析中发现了一些问题。首先，先前的Meta分析中纳入的文献只有14篇，并且在2015年之前发表。而且通过使用更全面的检索策略，发现了2015年之前发表的3篇文章具有误导性[33,39,43]，这些文章报道了KRAS突变联合LKB1低表达以及LKB1突变与肿瘤患者不良预后的相关性，明显纳入了混杂因素。并且2016年以来发布的几份新的研究可能会对以往的结论产生一定的影响，因此有必要重新分析LKB1表达与生存之间的相关性。其次，由于使用DFS/RFS/PFS作为结局变量的论文数量太少，无法在已发表的Meta分析中得出LKB1与该预后指标之间的结论，而我们的结果有望重新发现这一点。第三，以往的Meta分析仅包括回顾性队列研究。而病例对照研究也包括在本Meta分析中，并用于探索异质性的来源。第四，异质性的来源存在问题，应该根据相关变量将研究划分为亚组之后分析。

本研究结果表明，LKB1表达的下降与肿瘤患者的OS和DFS/RFS/PFS较差明显有关。然后通过进行亚组分析，并根据癌症类型、NOS得分、研究类型和影响因素来讨论异质性的来源，结果发现，将所有纳入的文章根据风险或保护因素分为两个亚组时，两部分的潜在异质性明显降低，这意味着风险或保护性因素可以部分解释OS和DFS/RFS/PFS中的异质性来源。虽然其他伴随变量并未显示出异质性的降低，在执行Meta回归后，无论是OS还是DFS/RFS/PFS，只有在影响因素P＜0.05的亚组中，才能进一步验证异质性来源的分析。本研究结果还表明，LKB1与预后结果之间的相关性在不同类型的肿瘤中发生了变化。在本研究无明显的出版偏倚，结果可以被认为是稳定的。敏感性分析结果显示在所有纳入的研究被逐一地排除之后，没有一个对OS和DFS/RFS/PFS的合并HR产生明显影响。考虑到这些方面，LKB1低表达可以导致较差的生存结局，LKB1表达水平可以被视为有价值的肿瘤预后独立预测因子和治疗靶标。

与先前的Meta分析一样，有2篇文章[17-18]显示了相反的结果。在Lee等[18]的研究中指出，癌细胞的存活需要激活Ras/Skp2/LKB1信号通路，即Skp2介导的LKB1多聚泛素化和复合物形成。而在Bouchekioua-Bouzaghou的研究中指出，细胞质中高水平的LKB1导致乳腺肿瘤细胞预后不良，亚细胞定位可能是产生相反结果的主要原因[17]。除此之外，研究者[54]还发现LKB1在肝癌细胞中下调可能引起其对5-氟尿嘧啶的耐药，所以更需要进一步研究去说明LKB1在肿瘤中的复杂作用。

不过，本研究同样存在局限性。首先，纳入文献中统计异质性相对较大。异质性的来源可能多种多样，包括患者的临床特征、LKB1的检测技术、样品的类型、纳入研究的方法等，而风险或保护因素只是异质性来源的一部分。第二，与癌症进展有关的因素很多，但由于篇幅有限，因此没有进行性别、年龄和其他类型的亚组分析。第三，在大多数文献中，利用免疫组织化学（IHC）检测LKB1蛋白的表达量，但尚无确定降低IHC的适当临界值以及LKB1表达降低的标准。第四，没有收集证据来证明LKB1表达与血液系统恶性肿瘤之间的关系。第五，几篇文章仅提供了Kaplan-Meier曲线，通过追踪点计算的HR和95% CI可能或多或少地存在偏差。最后，由于本文中评估的是多种肿瘤类型中低表达的LKB1与患者不良预后之间的关系，这也可能会导致结论的不准确性及摇摆性。

本研究证实了低表达的LKB1与多种类型肿瘤患者预后较差明显相关，LKB1有可能作为有价值的独立预测指标和治疗靶标，具有较高的临床应用价值。同时，本研究的结论需要更多后续的研究去证实。