一种绿色低毒的聚合物纳米粒子在过氧草酸酯和过氧化氢中的化学发光行为研究

王诗琪，王雨舟，黄明艳，陈福南

(西南大学 化学化工学院，重庆 北碚 400715)

0 引言

在众多经典化学发光反应中，过氧草酸酯化学发光(PO-CL)以其高量子产率的优点引起了广大研究者们的关注[1]。其中经典的体系由双(2,4,6-三氯苯基)草酸盐(TCPO)与过氧化氢组成，在反应过程中会产生一种寿命较长的活性中间体，称之为二氧杂环丁二酮(C2O4*)，当其与荧光物质共存时，中间体会将能量转移给荧光试剂，使化学发光信号增强[2]。除此之外，咪唑也可以作为TCPO-H2O2化学反应的催化剂，与TCPO形成一种中间产物1,1-草酰二咪唑(ODI)，提高发光速率，增强发光强度[3]。在后来的研究中，研究者们通过不同的荧光试剂以提高体系的发光强度，包括罗丹明6G[4]、红荧烯[5]、番红[6]等传统染料。然而，有机染料具有一定的毒性且不易降解使其应用受限，所以寻找新的荧光物质应用于TCPO-H2O2发光体系具有重要的意义。

与常规荧光染料相比，半导体量子点具有宽的吸收带和可调的窄发射，并且亮度可改善，具有光稳定性[7, 8]。然而，量子点毒性问题依旧是限制其应用于生物领域的关键问题。近年来，聚合物纳米粒子(PNPs)由于其亮度高、量子产率高，以及低毒、良好的生物兼容性和合成方式多样等特性，已经广泛地引起了很大关注[9-11]。PNPs在荧光成像、生物传感以及材料科学领域已有广泛应用[12-14]。

本文研究了PNPs在TCPO-H2O2体系中的发光行为，我们发现，在过氧化氢存在下，PNPs可以对体系产生增强的发光信号，对此提出了可能的机理，PNPs作为一种新型荧光纳米材料，与中间体二氧杂环丁二酮(C2O4*)发生能量共振转移使信号增强。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

过氧化氢(30%，V/V)、磷酸、丙酮均购自重庆川东化工有限公司；组氨酸、双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯(TCPO)购自上海源叶生物科技有限公司。1×10-2mol/L TCPO储备液由TCPO溶解在丙酮中得到，工作溶液通过稀释储备液得到，现配现用。实验用水均为超纯水，所有试剂均为分析纯。

超微弱化学发光检测仪(BPCL，北京建新力拓科技有限公司)，UV-2550紫外可见分光光度计(岛津公司，日本)，F-4500荧光分光光度计(日立公司，日本)，BILON超声波清洗器(上海比朗仪器制造公司)，Talos F200X透射电子显微镜(FEI公司，美国)，ESCALAB 250Xi-X射线光电子能谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)，格兰仕P70D20N1P-G5家用微波炉(格兰仕集团，广东)。过程中信号的捕获和数据的采集由Windows XP系统下的BPCL软件完成。

1.2 聚合物纳米粒子(PNPs)的制备

参照文献[15]，部分操作有改动，合成了水溶性聚合物纳米粒子(PNPs)。具体步骤为：2 g组氨酸溶于20 mL H3PO4溶液(0.5 mol/L)，均匀混合后置于微波炉(700 W)中加热3 min，冷却至室温，得到棕黑色固体物质。固体加入30 mL超纯水溶解，溶液在12 000 rpm下离心20 min，得到的上清液在超纯水中透析48 h进行纯化处理。最后的溶液存放于冰箱中4 ℃保存。

1.3 实验步骤

流动注射化学发光分析装置如图1所示，由两个恒流泵组成，一台泵输送TCPO和PNPs，另一台在相同流速下进行H2O2溶液和载流的运输。开启恒流泵，使PNPs溶液与TCPO在稳定流速下在反应盘管内充分混合，待基线平稳后，将H2O2溶液和载流与体系混合，化学发光信号由-750 C的工作电压下的光电倍增管放大采集，并被BPCL超微弱化学发光仪记录。用相对发光强度ΔI=I-I0对测定目标定量，公式中I与I0分别对应聚合物纳米粒子和空白溶液的发光强度。

图1 流动注射化学发光装置示意图Fig.1 Diagram of flow injection chemiluminescence system.High voltage:-750 V.The flow rates of P1 and P2 were both 2.0 mL/min

2 结果与讨论

2.1 聚合物纳米粒子(PNPs)的表征

聚合物纳米粒子的透射电镜(TEM)图像如图2A所示。由图2A可知，聚合物纳米粒子近似呈球形，粒径分布在20～70 nm范围之间，平均粒径为44 nm，而且PNPs属于单分散体系，没有存在聚集现象。根据在UV-2550紫外可见分光光度计和F-4500荧光分光光度计测量结果，图2B所示分别为紫外-可见吸收光谱(黑线)和荧光光谱(红线)，在紫外波长296 nm处有特征吸收峰，最大荧光发射波长为410 nm。并对PNPs进行光电能谱(XPS)表征(如图2C所示)，XPS结果显示该PNPs中存在C、N、O等3种元素。

图2 PNPs表征结果TEM(A)；紫外-可见吸收光谱和荧光光谱(B)；XPS(C)Fig.2 Characterization of PNPs.TEM (A); UV-vis spectra and Fluorescence spectra of PNPs (B); X-ray photoelectron spectroscopy (C)

2.2 化学发光动力学性质

我们进一步探讨了PNPs对TCPO-H2O2化学发光体系的影响结果如图3所示。当没有PNPs存在时，TCPO-H2O2化学发光体系仅呈现出较弱的CL信号(图3曲线a)；当PNPs存在时，该化学发光体系的CL信号显著增强(曲线b)。通过化学发光动力学性质研究表明，我们所制备的低毒的PNPs能显著增强TCPO-H2O2化学发光体系，有望于进一步拓宽其应用范围。

2.3 反应条件的优化

我们进一步优化新建立的PNPs-TCPO-H2O2化学发光体系中各自反应物的浓度以及泵流速。

过氧化氢作为体系的氧化剂，我们考察了H2O2浓度在0.02～0.4 mol/L范围内对发光体系化学发光(CL)信号的影响，结果如图4A所示。由图4A可知，当H2O2浓度为0.3 mol/L时，可以检测到最大CL信号，进一步增大H2O2浓度，CL信号保持不变。考虑到节约试剂成本的前提下，因此，我们选择0.3 mol/L的H2O2作为后续优化实验。

TCPO作为发光试剂，探究了TCPO在0.5×10-3～1×10-2mol/L范围内，对体系发光强度的影响。从图4B可知，当TCPO在0.5×10-3～1×10-3mol/L范围内，CL信号随TCPO浓度增加而提升，当超过1×10-3mol/L时，CL信号强度开始下降。最终，我们选择1×10-3mol/L为最佳浓度。

图3 化学发光动力学曲线TCPO-H2O2体系(a)；TCPO-H2O2-PNPs体系(b)Fig.3 Kinetic curves of CL system.TCPO-H2O2 (a); TCPO-H2O2-PNPs (b)

PNPs在体系中起到关键作用，在PNPs-TCPO-H2O2化学发光体系中起着增敏剂作用。探讨了PNPs与H2O的体积比在1∶40～1∶10(V/V)范围内对CL强度的影响。从图4C可以看出，CL强度随比值增大而逐渐增大，因此选择1∶10为最优体积比。随后对整个体系的流速进行优化(图4D)，当蠕动泵流速从1.0 mL/min到2.2 mL/min，CL强度持续上升，当达到2.0 mL/min时，信号达到最大，再增大流速，检测得到的CL信号趋于平稳。在此条件下，确定了最佳流速为2.0 mL/min。

图4 各种条件优化对化学发光信号的影响H2O2浓度(A)；TCPO浓度(B)；PNPs浓度(C)；流速(D)Fig.4 Effects of different optimized conditions on CL intensity. (A) Effect of H2O2 concentration,TCPO 1 mmol/L;VPNPs/VH2O=1∶10;flow rate 2.0 mL/min. (B) Effect of TCPO concentration,H2O2 0.3 mol/L;VPNPs/VH2O=1∶10;flow rate 2.0 mL/min. (C) Effect of PNPs concentration,H2O2 0.3 mol/L;TCPO 1 mmol/L;flow rate 2.0 mL/min. (D) Effect of flow rate,H2O2 0.3 mol/L;TCPO 1 mmol/L;VPNPs/VH2O=1∶10

2.4 机理探讨

TCPO-H2O2化学发光反应机理已有研究[16-18]。过氧草酸酯与过氧化氢反应可以生成一种寿命较长的活性中间体，二氧杂环丁二酮(C2O4*)，与荧光物质共存时，能迅速分解产生化学发光。其发光体被认为是二氧杂环丁二酮与荧光物质形成的电荷转移配合物，也可以认为是另一种激发态的配合物，此中间体不稳定会迅速分解，产生激发态的荧光物质和基态CO2。根据PNPs-TCPO-H2O2体系的化学发光光谱图(图5)，其最大发射峰位于480 nm左右，与荧光光谱有部分重叠，我们初步认为可能是发生了共振能量转移，二氧杂环丁二酮把能量转移给聚合物纳米粒子，形成激发态的PNPs*，PNPs*回到基态从而发光。

图5 PNPs-TCPO-H2O2体系的荧光光谱(a)与化学发光光谱(b)Fig.5 Spectrum of PNPs-TCPO-H2O2 system.Fluorescence spectrum (a) and CL spectrum (b)

为了验证上述我们的初步猜想，已有文献报道可通过改变反应试剂混合顺序探究其机理[2]。为此我们改变了反应试剂的混合顺序，探究其对发光强度的影响。与H2O2-TCPO体系的动力学(图2b)相比，通过将H2O2注入PNPs与TCPO混合溶液得到了最高的信号(见图6a)，其原因是混合前并未发生化学反应。而当把TCPO注入PNPs与H2O2混合溶液时，CL强度略有下降(见图6b)，说明PNPs与H2O2的反应产物有部分参与了整个体系的CL发射。将TCPO与H2O2混合，得到的信号最低(见图6c)，是中间产物(C2O4*)的快速形成与解离造成的。

图6 不同混合顺序的CL动力学曲线H2O2注入PNPs与TCPO的混合溶液(a)；TCPO注入H2O2与PNPs的混合溶液(b)；PNPs注入H2O2与TCPO的混合溶液(c)Fig.6 CL kinetics curve of different mixing sequence.H2O2 injected with TCPO and PNPs mixed solution (a); TCPO injected with H2O2 and PNPs mixed solution (b); PNPs injected with H2O2 and TCPO mixed solution (c)

3 结论

综上所述，本文合成了一种绿色低毒的聚合物纳米粒子(PNPs)，通过对TCPO、H2O2、PNPs浓度以及流速的优化，有效提高了TCPO-H2O2体系的化学发光信号，并对其可能的机理进行了探讨，建立了一种新的过氧草酸酯类的PNPs-TCPO-H2O2化学发光新体系，为进一步拓展PNPs-TCPO-H2O2新型化学发光体系应用于环境、生物、材料、药物、食品等领域的分析提供了潜在思路。