HSP90及c-Myc在小鼠肠道腺瘤癌变中的表达及相关性

沈晓东 张天 边涛

结直肠癌是全世界第3大高发恶性肿瘤，每年新诊断病例高达1200万［1］，在恶性肿瘤中病死率在全世界居第4位［2］。大量研究表明，WNT信号通路中β-catenin 及c-Myc等活性升高是大多数结直肠腺瘤癌变及结直肠癌形成及进展的重要特征［3-4］，其发病机制与MYC等原癌基因及APC等抑癌基因发生突变有关［4］，c-MYC是这些信号通路最重要的癌基因之一［5］。ApcΔ716/+小鼠模型具备典型的息肉-腺瘤-癌变过程，并且有与人类高度同源性、遗传性强、操作简便等优点，是国际公认的研究结直肠腺瘤癌变及结直肠癌的小鼠模型［6］。热休克蛋白作为分子伴侣与发生变性的蛋白结合而维持其正常的结构和功能，可分为HSP90、HSP70、小分子HSP等，其中HSP90在很多恶性肿瘤中表达明显升高，并且在恶性肿瘤的发生、发展及免疫反应中起着重要的作用［7］。本研究采用ApcΔ716/+小鼠，研究肠道腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的表达情况及相关性，为HSP90应用于预防肠道腺瘤癌变提供重要的理论依据。

1 实验方法

1.1 材料 HSP90鼠抗人单克隆抗体（ab13492）由艾博抗公司提供，c-Myc鼠抗人单克隆抗体（sc-40）圣克鲁斯生物技术公司提供，ECL发光试剂盒由阿默舍姆制药生物技术公司提供，标第一链合成系统Ⅱ由赛默飞生命科学公司提供，其他试剂均为实验用。

1.2 方法 （1）动物：ApcΔ716/+小鼠由Oshima教授馈赠，小鼠繁殖及扩增在SPF环境中，ApcΔ716/+雄性小鼠及野生型雌性小鼠进行交配扩增，剪取尾尖基因鉴定，选出ApcΔ716/+小鼠作为本实验用。（2）肠道腺瘤癌变的判定：通过对2～12周ApcΔ716/+小鼠肠道标本进行体视显微镜以及HE染色检测发现，4周开始出现肠道腺瘤，5～7周小鼠肠道腺瘤均为良性；8周时腺瘤开始出现癌变，癌变数为1～3枚/只，腺瘤癌变与大小有直接相关，故选取8周最大的肠息肉作为癌变的息肉（同时切取小部分HE染色证明其已经发生癌变），选取5周的1.0mm肠道良性腺瘤作为对照。

1.3 Western blot法检测腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的表达 通过体视显微镜采取5周正常黏膜、良性腺瘤及8周癌变息肉，细胞提取物通过10% SDSPAGE凝胶电泳分离及半干式转膜转膜，第一抗体选用鼠抗人HSP90及c-Myc抗体，滴加二抗，ECL发光试剂检测结果。

1.4 腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc免疫组织化学染色 选取5周及8周小鼠各8只，处死后分离肠道，福尔马林固定，石蜡包埋，5μm切片，通过HE染色明确腺瘤癌变部位；滴加HSP90或c-Myc单克隆抗体，4℃冰箱密封过夜，滴加二抗，温育30min后DAB显色。染色阳性判定标准：棕黄色颗粒沉积的部位为染色阳性，肿瘤细胞c-Myc全部为细胞核着色，HSP90则绝大部分细胞核染色，少部分肿瘤细胞细胞质轻微着色。HSP90及c-Myc蛋白质的相对表达量由染色细胞比率及着色强度的乘积来判定，由两名专业人员双盲下评分。

1.5 RT-PCR法检测腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的 mRNA 选取5周及8周ApcΔ716/+小鼠各16只，处死小鼠后，无RNA酶条件下分离出整个肠道，体视显微镜下切取5周小鼠良性腺瘤及8周癌变的息肉，Trizol 试剂盒提取总RNA，标第一链合成系统Ⅱ试剂盒合成Hsp90及c-Myc的cDNA，Hsp90及c-Myc的引物应用ABI PRISM引物设计软件确定，PCR扩增后使用ABI PRISM® 7000 型序列检测系统检测PCR反应结果。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料采用t检验或方差分析检验；相关性分析采用Pearson检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ApcΔ716/+小鼠肠道腺瘤癌变情况 4周开始出现肠道腺瘤，5周腺瘤总数为（7.6±3.1）个，均为良性腺瘤；8周小鼠肠道息肉总数为（68.8±12.8）个/只，其中出现癌变者（1.7±1.1）个/只，恶变与体积大小相关，体积较大者首先开始癌变。

2.2 肠道腺瘤癌变组织中的HSP90及c-Myc蛋白表达 通过蛋白电泳发现，正常肠黏膜HSP90及c-Myc表达量低，条带显示淡；5周时腺瘤内HSP90及c-Myc表达量升高，8周腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc蛋白条带明显增强，与良性腺瘤比较比较明显不同，见图1。

图1 HSP90及c-Myc在肠道腺瘤及腺瘤癌变组织中的表达

2.3 肠道腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc免疫组织化学染色 腺瘤癌变组织中HSP90染色阳性细胞明显增多，染色增强，绝大部分位于细胞核内，少部分位于细胞质内，其相对表达量为（6.91±1.19），较良性腺瘤（1.70±0.61）显著升高（t=-11.038，P＜0.001）；c-Myc免疫组织化学染色结果与HSP90相似，腺瘤癌变组织中c-Myc表达也明显增多，主要位于细胞核内，其相对表达量为（7.31±1.22），较良性腺瘤（2.14±0.80）也显著升高（t=-9.722，P＜0.001），见图2。

2.4 肠道腺瘤及腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的mRNA表达 腺瘤癌变组织中HSP90 mRNA表达量为（0.62±0.08），较良性腺瘤（0.21±0.06）明显升高（t=-17.246，P＜0.001）；腺瘤癌变组织中 c-Myc的mRNA表达量为（0.95±0.10），也较良性腺瘤（0.31±0.05）明显升高（t=-23.917，P＜0.001）。

2.5 肠道腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc表达的相关性 将腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的mRNA相对值等结果进行相关性分析，结果显示HSP90及c-Myc的mRNA表达存在明显的正相关（r=0.710，P=0.002）。同样，对免疫组织化学染色中HSP90及c-Myc的相对表达量相关性进行分析，结果与mRNA相对值相似（r=0.925，P=0.001）。

图2 肠道腺瘤及腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc免疫组织化学染色

3 讨论

目前HSP90在肿瘤方面研究日益深入，HSP90不仅在多种恶性肿瘤免疫治疗中起到重要的作用，血浆HSP90还可作为肿瘤标志物用于许多恶性肿瘤的诊断，HSP90-多肽复合物对胃肠道恶性肿瘤具有明确的抗肿瘤活性，并已经进入临床试验阶段，故HSP90适合作为肠道腺瘤癌变及结直肠癌免疫治疗的靶点而进一步深入研究。

原癌基因MYC突变后，其编码的蛋白c-Myc可以介导生物信号由细胞外转导入细胞核内，在肿瘤的形成及发展中起到重要的作用；大量研究表明c-Myc在肠道腺瘤形成及癌变中起到重要作用［8］；HSP90则通过c-Myc 参与很多恶性肿瘤的发生及发展过程［9］；本研究通过检测HSP90及c-Myc在ApcΔ716/+小鼠肠道腺瘤癌变组织中的表达及相关性，推测HSP90在肠道腺瘤癌变中的作用机制，为防治肠道腺瘤癌变提供新选择。

本实验中，在8周左右ApcΔ716/+小鼠腺瘤刚开始出现癌变，通过蛋白电泳、免疫组织化学染色及RT-PCR等实验方法证明，腺瘤出现癌变时，无论在mRNA水平还是在蛋白质水平HSP90及c-Myc均较良性腺瘤时显著升高；并且腺瘤癌变组织中，HSP90与c-Myc的mRNA表达及蛋白质表达均具有明显相关性，说明HSP90可能通过与c-Myc相互作用，参与肠道腺瘤癌变的调控。

HSP90参与肠道腺瘤癌变的机制目前尚不明确，Poole教授等［9］研究表明Myc-HSP90轴是维持许多恶性肿瘤发生及发展的关键，本实验研究结果与Poole教授的研究结果相似，HSP90及c-Myc在肠道腺瘤癌变组织中显著升高并具有相关性，提示HSP90可能通过c-Myc参与肠道腺瘤癌变，其作用机制可能有以下几个方面：（1）HSP90作为分子伴侣维持c-Myc正常构象及功能，促进肿瘤恶变，这可能是主要机制；（2）HSP90通过表观遗传过程参与c-Myc的转录调控，促进c-Myc的转录及翻译，提高c-Myc表达水平；（3）HSP90通过与一些转录因子相互作用，提高c-Myc的mRNA稳定性。但现阶段HSP90与c-Myc间具体信号通路尚不完全清楚，需要进一步研究明确HSP90 促进肠道腺瘤癌变的具体机制。

本研究中，在8周ApcΔ716/+小鼠肠道腺瘤开始出现癌变时，腺瘤癌变组织中HSP90及c-Myc的mRNA及蛋白质表达水平均较良性腺瘤显著升高，并且HSP90及c-Myc的表达具有明显相关性，提示HSP90通过c-Myc参与肠道腺瘤癌变。本研究探索了HSP90在肠道腺瘤癌变中表达的及作用机制，为预防肠道腺瘤癌变提供新策略。