基于光电倍增管的管式发光检测仪的设计与开发

王卫伟

（广州博鹭腾仪器仪表有限公司，广州 510006）

0 引言

生物发光和化学发光在生物分子学研究方面应用越来越广。常用的检测方法有成像法和光子计数法，两者相比，光子计数法具有灵敏度高、检出限低、动态范围宽的特点[1]。

目前国内研究生物发光检测仪器的多以ATP为检测对象，但是在ATP浓度与生物发光强度之间的线性关系和检出限都一般[2-3]，试剂消耗成本高，经济效益差，数据的可靠性也不高。本文作者设计开发了一种基于生物发光和化学发光原理的多功能管式发光仪，通过设计更好的光电倍增管外围电路，能够实现更低检出限，更好线性检测。通过样机测试，达到了预期效果，产品试用也得到用户的认可。

1 基本原理及应用

1.1 生物发光与化学发光原理及应用

生物发光常用的试剂是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelen⁃terazine）和氧气。萤火虫荧光素酶与ATP作用机理如下[4]：

ATP是各种活体生物能量的主要来源，利用荧光素酶则能检测超微量10-16mol/L的ATP，上述这个特性决定了荧光素酶与ATP能构成很好的生物传感器[5-6]，用于多种生物检测。

化学发光常用试剂是鲁米诺（Luminol）及其衍生物，在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在辣根过氧化物酶（HRP）的作用下，发出荧光，其化学发光反应式如图1所示。

图1 鲁米诺化学反应式

辣根过氧化物酶作为广泛应用的标记用酶，通过与鲁米诺组合，其应用也十分广泛。基于以上生物发光和化学发光原理，设计了一款能够检测微弱光的管式发光检测仪，其应用如下。

（1）报告基因分析

在基因调控及药物研发的基础实验中，使用荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、碱性磷酸酶以及成为获得高灵敏度检测的标准方法[7-9]。特别是双重化学发光分析技术，例如双荧光素酶报告基因分析法，已经成为备受欢迎的技术手段，因为它可实现细胞转染效率的内部控制，达到基因大量表达的技术水平。

（2）半胱天冬酶测定

检测半胱天冬酶的行为（a group of cysteine-aspartic acid peptidases）是研究细胞凋亡的重要方法[10-11]。这类实验主要围绕半胱天冬酶3、7、8、9特定的多肽底物设计，在酶存在时多肽会被分解，从而显示细胞处于凋亡期。生物发光技术可以完成此类实验，通过标记发光底物Luciferin，在Luciferin催化下发出光信号来指示半胱天冬酶的存在。

（3）ATP检测

基于荧光素酶反应产生发光的ATP实验，由于所有活细胞中均包含ATP，因此可通过检测ATP，实现细胞凋亡、细胞增殖实验或者细菌检测与分析[12]。

（4）水样毒性分析

当生物发光菌，如Vibrio fischeri，接种到含有毒物水样时，它们失去了依赖于水样毒性的发光能力[13]。

（5）发光底物进行免疫分析[14-16]

通过改变辣根过氧化物酶或磷酸酶的发色底物为发光底物，会使检测精度提高百倍。

（6）化学发光检测

鲁米诺（Luminol）及其衍生物，吖啶酯、AMPPD等发光检测[17]。

1.2 PMT的基本原理

光电倍增管是一种真空管，如图2所示，它由入射窗、光阴极面、倍增系统和阳极等组成。入射光穿透入射窗到达光阴极面，激励光阴极面的光子向真空中放出电子（外光电效应），光子经聚焦极汇集到第一倍增极，然后再相继经过各倍增管极（发射二次电子），进行二次电子倍增，最后由末级倍增极发射二次电子通过阳极输出。

图2 端窗式光电倍增管的构造图

二次电子发射系数δ是倍增极间电压E的函数，可用下式表示：

通常把入射到第一倍增极有效部分的光电子的几率称为收集效率（α），α为常数，k由电极的结构和材料决定，一般在0.7～0.8的范围。

从光阴极面发射的光电流Ik，入射到第1倍增极，发射出二次电子流Id1，这时对于第1倍增极的二次发射系数δ1可用，表示为：

该电流从第1倍增极到第2倍增极，直到第n倍增极连续倍增。第2倍增极以后n级的二次电子发射系数δn可用下式表示：

阳极电流由下式给出：

式中：α为收集效率，把α·δ1·δ2…δn叫做电流增益，用μ表示：

若α=1，光电倍增管倍增级数为n，均分压时，电流增益μ对工作电压V的变化有以下关系式

由A=α（n）kn为常数可知，电流增益与工作电压的kn次方成正比。

PMT的工作电压通常为1～2 kV，光电倍增管倍增级数一般在10级以上，因此经过逐级倍增之后，PMT的增益可达百万以上，满足对单个光子的测量要求，因此可以实现超微量的生物发光和化学发光的检测。

基于以上生物应用和光电倍增管原理，开发了一款管式发光检测仪，最小检测体积可达10μl，检测灵敏小于20 amol ATP，可使用1.5 mL、2 mL的Eppendorf管或者12 mm×60 mm、12 mm×55 mm、12 mm×47 mm的试管。

2 系统设计

本发光检测仪包括PMT及其外围电路，滤波电路，放大器，甄别器，计数器，控制模块以及人机交互界面，如图3所示。生物试剂或者化学试剂发生反应产生的光子信号，经过PMT转化后通过阳极输出为脉冲电流信号，经滤波电路与放大电路进行电压转换，信号放大后送到脉冲高度甄别器，再进入计数器进行脉冲计数，并通过显示屏显示计数值，即样品发光强度。

人机交互界面即电容式触摸显示屏，除了能显示样品发光强度以外，也可以通过显示屏输入检测时间参数，如检测开始间，检测时长等。

图3 系统方案

2.1 PMT选型

光电倍增管的倍增极有许多种类，如环形聚焦型、盒栅型、直线聚焦型、百叶窗型等等，由于它的结构、级数的不同而使得电流增益、时间响应特性、均匀性、二次电子收集效率特性等不同，另外其电气特性不仅取决于倍增极的种类，还与光阴极面大小和聚焦系统有关，因此要根据使用目的作相应的选择，光电倍增管倍增极特性如表1所示。

表1 各种倍增极的特性[1]

本设计主要是用来做生物发光或化学发光检测的，由于实验使用试剂多数比较昂贵，超微用量，因此试剂光信号非常弱，所以需要高收集效率的光电倍增管，基于这个原因选择高收集效率的盒栅型光电倍增管，另外其均匀性等特点也满足要求。推荐型号为英国ET公司9124B，日本滨松CR110等。

2.2 PMT外围电路

PMT的外围电路包括高压电路和偏置电路[18]。光电倍增管对高压供电电源和偏置电压的稳定性要求比较高，在精密光辐射测量中，通常要求电源的稳定度达到0.01%～0.05%。PMT厂家一般有相应的标准模块出售，如高压电路模块、偏置电路模块、高压电路及偏置电路模块以及信号调理电路等单个或者组合模块。因此常规应用，可根据需求直接采购标准模块，如果追求至极性能，又想控制成本，可以考虑自己开发。本产品由于是针对的生命科学研究领域，更高的性能是首选，因此全部自己开发。

追求PMT更高的性能情况下，要求PMT输出电流稳定在1%以内，而高压电源的稳定性则必须优于0.1%。具体实施方案如下：首先通过数字电位器将系统电源变成输出可调的电压信号，再经过电流放大器将功率放大，接着通过多谐振荡器将直流信号自激转变为方波信号，再经过变压器与倍压电路升压转换成高压脉冲信号，然后通过滤波电路将高压脉冲信号转变为直流信号，最后将高压直流信号加载到PMT偏置电路上，为PMT倍增极提供电源。通过控制器（如单片机）调整数字电位器的输出电压值，即可调节PMT高压电路输出高压值的大小，以解决同型号PMT，高压值存在偏差的问题。电源方案如图4所示。

图4 直流高压电源方案

偏置电路方案可以分为两类，分别是无源偏置电路和有源偏置电路。无源偏置电路由电阻组成，由于PMT的工作电压高达千伏，且其增益线性必须保证1%的精度，因此分压器微安级的电流，必须使用高阻值大功率电阻，这样导致偏置电路的体积过大，且发热量过大。由于偏置电路的直接与PMT管脚相连，其热量易通过金属管脚导入PMT，进而增加PMT的热噪声，影响仪器检测下限。常用的有源分压为晶体管与电阻构成的偏置电路，二极管和电容组成的整流器偏置电路，以及场效应管与电阻构成的偏置电路，其中以场效应管与电阻构成的偏置电路的偏置电压线性度和稳定性更好，因此选用场效应管与电阻构成的偏置电路，如图5所示的正高压场效应管偏置电路。实测时，阳极电流不超过50μA，增益线性满足小于1%的要求。

图5 场效应管与电阻构成的偏置电路

2.3 信号调理电路

PMT的高压电路接线方式分为阳极接地和阴极接地。在光子计数的条件下，是让接地的发光体与PMT光电面紧密贴在一起，为此采用阴极接地，阳极接高压的方法。这时，为了使阳极加的正高压信号与光子产生的电脉冲信号分离，通过使用耦合电路，隔离直流高压信号，只允许光子产生的脉冲信号通过。特别注意的是，为保证不受耦合电容的影响，输入波形不失真地传达到输出波形，回路的时间常数CR（R是Ra、RL的并联电阻）必须比阳极输出脉宽大数十倍以上。

如图6所示，经耦合电路隔离直流高压信号以及通过PMT输出负责电阻RL将PMT输出的电子流信号转换为电压信号后，PMT输出的脉冲信号进入放大器，将脉冲信号放大，接着进入比较器，通过设定的阈值，将模拟脉冲信号转变为数字脉冲信号，再经过计数器，然后进入控制器并通过显示屏显示数据。

图6 PMT信号调试电路

PMT输出脉冲信号的上升时间小于10 ns，因此需要选择高频大带宽的放大器，如日本Renesas的HFA1109、EL5462。比较器可选用美国Maxin的MAX9201，比较器电路一般设有低甄别阈值（LLD）和高甄别阈值（ULD），放大器输出脉冲与阈值进行比较，这样既可以排除（甄别）掉脉冲幅度比LLD低的脉冲，也可以排除（甄别）掉脉冲幅度比ULD高的噪声，但是通常情况下只设置地甄别阈值脉冲即可满足要求。

PMT可输出高达百万脉冲/秒，且常用单片机的工作频率基本都在100 MHz以下，因此在数字脉冲信号进入单片机之前，先经过高速计数器对脉冲进行计数，以满足常规单片机的使用。单片机接收到计数值以后，通过显示屏显示样品发光值，另外计数器电路设计有门电路，因此可以通过显示屏设定任意测试时间，包括开始时间，测试时长等。

3 ATP实验测试及结果分析

3.1 实验内容

（1）标准ATP液浓度

原倍ATP液浓度：10-7M=1.0×10-13mol/μL。用ATP-Free Water进行稀释配置不同ATP浓度标准液（注意：由于ATP原液浓度检测读数并不是很高，所以稀释浓度梯度未设置为10，而是以3为梯度来稀释） 。

（2）反应体系

每管：100 μL 各浓度梯度ATP 标准品+100 μL Re⁃agent。

（3）检测方法

每个样本逐个检测，检测参数：counting 5 s。灵敏度计算公式：每孔检出极限=ATP标准液浓度×体积×（3×空白值标准偏差） /（标准样品读数-空白孔平均值）。

3.2 实验结果及分析

从图7所示的ATP实验数据拟合曲线I和II中，可知在5.2×10-18～1.0×10-13之间取值的话，R2=0.995 3，线性良好；在1.5×10-17～1.0×10-13之间取值的话，R2=0.999 96，线性优秀。数据线性与某进口品牌检测结果相差不大，也验证了仪器设计达到了要求。

取1.4×10-16mol/μL检测数据，来计算灵敏度：

灵敏度=（1.4×10-16×100×3×0.47）/（1 534-128） =0.14×10-16(mol)，即14 amol ATP。

但是目前国际上性能最好的设备，检测灵敏度可达个位数的amolATP。灵敏度上还有差距，而且在低浓度时，线性不够好。初步诊断为光路对样品发光的收集效率不够高，目前光路方案使PMT仅能收集发光样品一个侧面的光，无法将样品发出的光全部收集起来，接下来将参考积分球原理，对光路进一步优化。

图7 ATP实验数据拟合曲线

4 结束语

通过研究光电倍增管的特性及其与生物研究应用的结合的特点，开发了一款基于单光子计数器的管式发光检测系统。系统包括单光子计数器（光电倍增管）、放大器、甄别器、分频器、计数器以及显示屏。通过实验测试，仪器的灵敏度及线性关系达到了设计要求，性能基本上达到了国际一线水平，后续将进一步优化，使仪器有更高的灵敏度和更好的线性。