爵床提取物抗炎镇痛作用的实验研究

梁生林，钟卫华，李庆耀，褚洪标，周细根

药物与试剂

爵床提取物抗炎镇痛作用的实验研究

*梁生林1，钟卫华2，李庆耀1，褚洪标1，周细根1

(1．井冈山大学医学部，江西 吉安 343009；2．井冈山大学附属医院，江西 吉安 343000)

探讨爵床提取物的抗炎镇痛作用。采用致炎剂二甲苯引起小鼠耳肿胀、新鲜蛋清引起大鼠足跖肿胀2种急性炎症模型以及棉球引起大鼠肉芽肿慢性炎症模型，研究爵床提取物灌胃给药对急慢性炎症的作用。采用热板法、醋酸扭体法和甲醛法致痛，研究爵床提取物灌胃给药的镇痛作用。与纯化水对照组相比，爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组对致炎剂二甲苯所引起的小鼠耳廓肿胀抑制显著（< 0.01，< 0.05），对蛋清所引起的大鼠足跖肿胀抑制显著（< 0.01），对大鼠棉球肉芽肿抑制显著（< 0.01）。爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组给药后对热板所引起的小鼠痛阈值明显提高，与纯化水对照组和自身给药前比较差异明显（< 0.01，< 0.05）；爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组对致痛剂醋酸所引起的小鼠扭体反应次数明显减少，也明显抑制甲醛所引起的早期（0~5 min）和晚期（15~30 min）小鼠足痛反应，与纯化水对照组比较差异显著（< 0.01）。爵床醇提取物的抗炎镇痛作用比水提取物强（< 0.01，< 0.05）。爵床提取物灌胃给药具有一定抗炎、镇痛作用，且醇提取物强于水提取物。

爵床；醇提取物和水提取物；抗炎；镇痛

爵床[(Liun.) Nees]是一种常见中草药，它是爵床科植物爵床的干燥全草，主要分布于我国西南部和南部各省，曾经收载于1977年版《中国药典》一部[1]。具清热解毒、消除疳积的功效作用[2-4]。爵床主要含木脂素类[5-8]、黄酮类[7-9]等化合物，具有抗肿瘤[5,6,9, 10-13]、抗病毒[14]、抗菌[15-16]、抗血小板凝集[17]等作用。在前期研究中课题组发现，腹腔注射爵床水煎剂对化学刺激物二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀有明显抑制作用，对热板引起的小鼠疼痛也有明显镇痛作用[18]。但爵床提取物灌胃给药在抗炎镇痛方面是否有作用，不同提取物在抗炎镇痛作用强度方面是否有明显不同，尚未见文献报道。本研究探讨爵床醇提取物和水提取物灌胃给药对致炎剂二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀、蛋清引起的大鼠足跖肿胀及棉球致炎的抗炎作用，以及小鼠热板引起的疼痛、醋酸引起的扭体及甲醛法致痛的镇痛作用，其目的是为爵床的临床应用和进一步开发利用提供实验的依据。

1 材料

1.1 动物

清洁级昆明种小鼠，体重18~22 g，雄雌兼有；清洁级SD大鼠，体重180~220 g，雄雌各一半，它们都是由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 药物与试剂

爵床采于江西省吉安市，经井冈山大学医学部药学系周秋贵副教授鉴定为爵床科植物爵床[(Liun.) Nees]；阿司匹林肠溶片，规格：25 mg，批号：130525，石家庄康力药业有限公司；盐酸吗啡注射液，规格：1mL:10 mg，批号：130806-2，东北制药集团公司沈阳第一制药厂；二甲苯，批号：20060201，中国上海试剂一厂；戊巴比妥钠，批号：WS20110112，上海西唐生物科技有限公司；36%醋酸，上海松江佘山化工厂；甲醛为市售分析纯试剂。

1.3 仪器

RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；SHB-A循环水式多用真空泵，上海豫康科教仪器设备有限公司；YLS-25A电动耳肿打耳器，济南益延科技发展有限公司；PV-200足肿容量测量仪，成都泰盟软件有限公司；RB-200智能热板仪，成都泰盟软件有限公司；电子天平，上海精密科学仪器有限公司；电热恒温干燥箱，上海新苗医疗器材制造有限公司。

2 方法

2.1 爵床提取物的制备

2.1.1 醇提取物的制备

取干燥的爵床粗粉225 g，用浓度为80%乙醇浸泡24 h后用回流装置在水浴中加热回流提取3次，第1次回流1 h，后2次各0.5 h，把3次回流提取液合并，回收乙醇，蒸干至干浸膏，计入其重量并换算每克干浸膏相当原药材的重量，贮存备用。用时用纯化水配成所需浓度。

2.1.2 水提取物的制备[19]

把225 g切成小段的干燥爵床用12倍纯化水浸泡0.5 h，煎煮1 h，过滤，第2、3次各加10倍量纯化水煎煮0.5 h，过滤，把3次煎出液合并，静置除渣，浓缩至流浸膏，计入其体积并换算每毫升流浸膏相当原药材的重量，贮存备用。用时用纯化水配成所需浓度。

2.2 爵床提取物的抗炎实验

2.2.1 耳肿法[20-21]

根据随机数字表法，将72只雄雌各半昆明种小鼠按体重和性别随机均分为6组：纯化水对照组，阿司匹林阳性组（0.5 g/kg），爵床醇提取物高、低剂量（7.5 g生药/kg、3.75 g生药/kg）组，爵床水提取物高、低剂量（7.5 g生药/kg、3.75 g生药/kg）组。小鼠均采用灌胃给药，灌服的容量为10 mL/kg，连续灌胃5 d，1次/d。最后1次灌胃给药后1 h给每只小鼠左耳廓两面均匀涂擦致炎剂二甲苯0.05 mL引起耳廓肿胀，右耳廓不涂擦作对照。0.5 h后颈椎脱臼法把小鼠处死，用剪刀沿着耳根部把双耳剪下，用直径为8 mm的电动耳肿打耳器在左右耳相同的位置分别打下圆形耳片，精确称重，计算耳肿胀度和肿胀抑制率。耳肿胀度＝左耳片重量－右耳片重量。耳肿胀抑制率（%）=（对照组耳肿胀度－给药组耳肿胀度）/对照组耳肿胀度 × 100%。

2.2.2 足肿法[20-21]

根据随机数字表法，将60只雄雌各半SD大鼠按体重和性别随机均分为6组：纯化水对照组，阿司匹林阳性组（0.5 g/kg），爵床醇提取物高、低剂量（7.5 g生药/kg、3.75 g生药/kg）组，爵床水提取物高、低剂量（7.5 g生药/kg、3.75 g生药/kg）组。大鼠均采用灌胃给药，灌服的容量为10 mL/kg，连续灌胃5 d，1次/d。最后1次灌胃给药后1 h，给每只大鼠左后足跖皮下注射新鲜配制的0.1 mL 10%蛋清生理盐水溶液致炎，用PV-200足肿容量测量仪分别测定各鼠致炎前足跖容量及致炎后第1、2、4、6 h的足跖容量，记录结果，并计算足肿胀率（%）。足肿胀率（%）＝（致炎后足跖容量－致炎前足跖容量）/致炎前足跖容量 × 100%。

2.2.3 棉球法[20-21]

大鼠分组组数和方法与“2.2.2”项相同。腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，在大鼠左右两侧蹊部先用碘伏消毒后用酒精脱碘后，用手术刀各切长约1 cm的切口，然后把重20 mg的灭菌棉球（10 g/L氨苄西林液浸泡，烘干）用眼科镊从切口处塞入大鼠皮下，再将切口缝合。第2 d开始灌胃给药，灌服的剂量与“2.2.2”项相同，连续灌服7 d。第8 d颈椎脱臼法处死大鼠，将原切口挑开，把棉球及其周围结缔组织一并取出，将脂肪组织剔除，放于恒温电热干燥箱，把温度调到60 ℃干燥24 h，称重。将称得的重量减去棉球原重量即得肉芽肿重量，计算肉芽肿抑制率。肉芽肿抑制率（%）＝（对照组肉芽肿重量－给药组肉芽肿重量）/对照组肉芽肿重量 × 100%。

2.3 爵床提取物的镇痛实验

2.3.1 热板法[19-20]

热板加热至（55.0 ± 0.1）℃，记录小鼠从放入热板至出现舔后足反应所需的时间（s），以此时间作为该鼠的痛阈值，剔除痛阈值小于5 s或大于30 s以及跳跃者。根据体重将72只筛选合格的雌性小鼠随机均分为6组，除了阳性对照组由阿司匹林改为盐酸吗啡（0.02 g/kg）外，剩下各组与“2.2.1”项相同。每鼠各测2次正常痛阈值，2次测定间隔时间为10 min，取2次测得数值的平均数作为每鼠给药前正常痛阈值。阳性对照组给药为皮下注射吗啡溶液2 d，其余各组均灌胃给药，给药剂量和时间均与“2.2.1”项相同。最后1次给药后30、60、90、120 min各测定小鼠的痛阈值，如果放入热板60 s仍无舔后足，马上取出小鼠，此小鼠的痛阈值就按60 s来计算。

2.3.2 醋酸扭体法[19-20]

小鼠分组及给药均与“2.2.1”项相同。最后1次灌胃给药后1 h，每只小鼠均用0.6%新鲜配制的醋酸0.2 mL腹腔进行注射。观察并记录小鼠在注射醋酸后15 min内因疼痛而出现的扭体反应的次数，并计算抑制率。抑制率（%）=（对照组扭体反应次数－给药组扭体反应次数）/对照组扭体反应次数 × 100%。

2.3.3 甲醛法[22]

72只雄雌各半小鼠，按体重和性别随机均分为6组，组别及给药与 “2.3.1”项相同。末次给药后1 h，每鼠右后足背皮下注射0.92%甲醛（生理盐水配制）20 μL。将小鼠舔、咬右后爪的时间长度作为疼痛反应的指标。观察并记录0~5 min，15~30 min反应时间。抑制率（%）=（对照组平均反应时间-给药组平均反应时间）/对照组平均反应时间 × 100%。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

与纯化水对照组相比较，爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组对致炎剂二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀抑制均明显（< 0.01，< 0.05），且耳廓肿胀抑制率与剂量呈正相关；阿司匹林组对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀也抑制显著（< 0.01）。爵床醇提取物高、低剂量组与阿司匹林阳性对照组相比较，差异无统计学意义（> 0.05）。爵床醇提取物与水提取物各对应剂量组比较，差异有统计学意义（< 0.05），显示醇提取物作用比水提取物强。结果见表1。

表1 爵床提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响（, n = 12）

注：与纯化水组比较，*< 0.05，**< 0.01；与阿司匹林组比较，#> 0.05；与水提取物组比较，&< 0.05

3.2 对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响

与纯化水对照组相比较，爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组以及阿司匹林组对蛋清所引起的大鼠足跖肿胀抑制均显著(< 0.01)。爵床醇提取物低剂量组给药后4、6 h与相同剂量的水提取物组相比较，差异显著(< 0.01，< 0.05)。结果见表2。

表2 爵床提取物对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响(,n = 10)

注：与纯化水组比较，**< 0.01；与水提取物组比较，&< 0.05，&&< 0.01

3.3 对大鼠棉球肉芽肿的影响

与纯化水对照组相比较，爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组和阿司匹林组对大鼠棉球肉芽肿慢性炎症抑制作用均显著（< 0.01）。结果见表3。

表3 爵床提取物对大鼠棉球肉芽肿的作用（, n =10）

注：与纯化水组比较，**< 0.01

3.4 对热板法致小鼠疼痛的影响

与纯化水对照组相比较，给药前各组痛阈值差异没有统计学差异（> 0.05）；爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组，灌胃给药后30、60、90、120 min对热板引起的小鼠痛阈值具明显提高(< 0.01，< 0.05），且具剂量依赖性；吗啡溶液组给药后30、60、90、120 min对热板引起的小鼠痛阈值也显著提高（< 0.01）。

与自身给药前相比较，纯化水对照组差异无统计学意义（> 0.05）；爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组和吗啡溶液组，给药后30、60、90、120 min对热板引起的小鼠痛阈值提高显著（< 0.01）。

爵床醇提取物高、低剂量组给药后与相同剂量的水提取物组相比，差异显著（< 0.01，< 0.05），显示爵床醇提取物作用比水提取物强。结果见表4。

表4 爵床提取物对小鼠热板法痛阈值的影响（, n = 12）

注：与纯化水组比较，*< 0.05，**< 0.01；与自身药前痛阈比较，##< 0.01；与水提取物比较，&< 0.05，&&< 0.01

3.5 对醋酸致小鼠扭体反应的影响

与纯化水对照组相比较，爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组和阿司匹林组对醋酸致痛引起的小鼠扭体反应次数均明显减少（< 0.01）。爵床醇提取物高、低剂量组给药后与相同剂量的水提取物组相比较，差异显著（< 0.01），显示爵床醇提取物作用比水提取物强。结果见表5。

表5 爵床提取物对小鼠扭体次数的抑制作用（, n = 12）

注：与纯化水组比较，**< 0.01；与水提取物组比较，&&< 0.01

3.6 对甲醛法所致小鼠疼痛的影响

与纯化水对照组相比较，爵床醇提取物和水提取物高、低剂量组和吗啡溶液组给药后均显著缩短皮下注射甲醛后0~5 min和15~30 min小鼠舔足时间(< 0.01)。爵床醇提取物高、低剂量组给药后与相同剂量的水提取物组相比，差异显著（< 0.01），显示爵床醇提取物作用比水提取物强。结果见表6。

表6 爵床提取物对甲醛致小鼠疼痛的影响（, n = 12）

注：与纯化水组比较，**< 0.01，与水提取物组比较，&&< 0.01

4 讨论

本实验采用化学致炎剂二甲苯引起小鼠耳廓肿胀及鸡蛋清引起大鼠足跖肿胀都是急性炎症反应，采用大鼠埋棉球引起肉芽肿是以增生为主的慢性炎症反应[20]。本实验爵床醇提取物和水提取物灌胃给药后，对化学致炎剂二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀和鸡蛋清引起的大鼠足跖肿胀均具明显减轻，对棉球引起的大鼠肉芽肿增生具显著抑制，表明爵床灌胃给药对急慢性炎症具有显著抑制作用。

在镇痛实验中，采用了热板法、醋酸扭体法和甲醛法进行实验。小鼠热板实验是通过一定的温度（55 ℃）刺激小鼠足部以产生缩足、舔足等疼痛反应。常以热刺激开始至出现舔后足反应的时间（痛阈值）为测痛指标[20]，并以此评价药物的镇痛作用。本实验爵床醇提取物和水提取物灌胃给药后对热板刺激引起的小鼠痛阈值具明显提高，表明爵床灌胃给药对温度等物理因素导致的疼痛有镇痛作用。热板反应有高位中枢参与[23]，这说明爵床有一定中枢性镇痛作。

小鼠醋酸扭体实验是通过醋酸刺激小鼠腹膜壁层和脏层引起炎性疼痛，表现为腹部内凹、伸展后肢等扭体反应，其是筛选弱镇痛药的一种敏感、简便、重复性好的方法[23]。本实验中，爵床醇提取物和水提取物灌胃给药后对化学刺激物醋酸诱导的小鼠扭体反应次数具明显减少，提示爵床灌胃给药对炎症性疼痛有一定的镇痛作用。

小鼠甲醛实验能较好地模拟临床慢性严重疼痛。小鼠足爪皮下注射甲醛出现典型的两阶段疼痛反应，一是注射甲醛后5 min内，二是注射甲醛后15~30 min。这两个阶段引起疼痛的机制不同，注射甲醛后5 min内疼痛反应主要是直接刺激C纤维所致，注射甲醛后15~30 min疼痛反应有炎症机制参与。吗啡等中枢镇痛药能抑制两阶段疼痛反应，阿司匹林等外周镇痛药只能抑制第二阶段的疼痛反应[22-23]。本实验中，爵床醇提取物和水提取物灌胃给药后对两阶段疼痛反应均有显著抑制作用。结果提示爵床灌胃给药既可通过中枢，亦可同时通过外周炎性疼痛过程中的某个环节发挥镇痛作用。

实验结果也表明，在抗炎、镇痛作用方面，作用强度与剂量呈正相关，而且爵床醇提取物作用比水提取物强。

综上，本实验采用了3种炎症动物模型和3种疼痛动物模型来研究爵床提取物的抗炎镇痛作用。实验结果表明，爵床提取物灌胃给药对急、慢性炎症均具有良好的抑制作用；在镇痛方面，无论是物理性疼痛，还是炎症性疼痛，无论是急性疼痛，还是慢性疼痛都具有明显的镇痛作用，而且兼有良好的中枢和外周镇痛活性；在抗炎镇痛方面醇提物作用比水提物强。实验结果为其临床应用和综合开发利用提供了一定的实验依据。但其发挥主要抗炎镇痛作用的是哪种活性成分，对哪些致痛和致炎介质有影响，有什么样影响，这些有待于后续更深入的研究。

[1] 中华人民共和国药典委员会.中国药典一部[S].1977: 662-663.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典下册[M].上海:上海人民出版社, 1977: 2682.

[3] 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编(上册)[M].2版.北京:人民卫生出版社, 1996: 955-956.

[4] 上海市食品药品监督管理局.上海市中药材饮片炮制规范[M].上海: 上海科学技术出版社, 2008: 311-312.

[5] Weng J R, Ko H H, Yeh T L, et al.Twonewarylnaphthalidelignans and antiplateletconstituents from Justiciaprocumbens[J].Arch Pharm (Weinheim), 2004, 337(4): 207-212.

[6] Yang M, Wu J, Cheng F, et al.Complete assignments of 1H and 13C NMR data for seven arylnaphthalide lignans from Justicia procumbens[J].Magn Reson Chem, 2006, 44(7): 727-730.

[7] 吴威巍,缪刘萍,王鑫杰.爵床化学成分研究[J].中成药, 2013, 35(5): 985-988.

[8] 张雅奇.爵床乙酸乙酯部位化学成分及其质量分析研究[D].武汉:湖北中医药大学, 2013: 8-29.

[9] 李飒, 张卫东.中药爵床化学成分的研究[J].药学实践杂志, 1996, 14(3): 151-152.

[10] Lee J C, Lee C H, Su C L, et al.Justicidin A decreases the level of cytosolic Ku 70 leading to apoptosis in human colorectal cancer cells[J].Carcinogenesis, 2005, 26(10): 1716-1730.

[11] Su C L, Huang L L, Huang L M, et al.Caspase-8 acts as a key upstream executor of mitochondria during justicidin A-induced apoptosis in human hepatoma cells[J].FEBS Lett, 2006, 580(13): 3185-3191.

[12] 张鹏,周伟勤,董宪喆,等.6’-羟基爵床定A对肿瘤细胞的抑制活性及其对肿瘤细胞氧化还原系统的影响[J].中国药理学与毒理学杂志, 2010, 24(3): 207-213.

[13] He X L, Zhang P, Dong X Z, et al.JR6, a new compound isolated from Justicia procumbens, induces apoptosis in human bladder cancer EJ cells through caspase- dependent pathway[J].J Ethnopharmacol, 2012, 144 (2): 284-292.

[14] Asano J, Chiba K, Tada M, et al.Antiviral activity of lignans and their glycosides from Justicia procumbens[J].Phytochemistry, 1996, 42(3): 713-717.

[15] Zhang Y, Bao F, Hu J, et al.Antibacterial lignans and triterpenoids from Rostellularia procumbens[J].Planta Med, 2007, 73(15): 1596-1599.

[16] 曾志红,何建仁.三种常见植物体外抑菌活性的初步研究[J].莆田学院学报, 2009, 16(5): 36-38.

[17] Chen C C, Hsin W C, Ko F N, et al.Antiplatelet arylnaphthalide lignans from Justicia procumbens[J].J Nat Prod, 1996, 59(12): 1149-1150.

[18] 刘兵,郑丽娟,梁生林,等.爵床煎剂对小鼠镇痛抗炎作用初探[J].井冈山大学学报:自然科学版,2015, 36(4): 70-74.

[19] 钟卫华, 罗辉, 苏丹丹, 等.陆英不同部位水提液抗炎镇痛作用的比较研究[J].井冈山大学学报:自然科学版, 2018, 39(3): 88-92.

[20] 陈奇.中药药理研究方法学[M].2版.北京:人民卫生出版社, 2006: 346-368.

[21] 梁生林,黄芳辉,钟兴华,等.乌蔹莓抗炎镇痛有效部位的筛选[J].中草药,2016, 47(4): 634-639.

[22] 张凤云,库宝善,姚海燕,等.Indoxacarb的镇痛抗炎效应[J].中国临床康复, 2006, 10(30): 115-117.

[23] 徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京: 人民卫生出版社, 2005: 882-887.

EXPERIMENTAL STUDIES ON THE ANTI-INFLAMMATORY AND ANALGESIC EFFECT OFEXTRACT

*LIANG Sheng-lin1, ZHONG Wei-hua2, LI Qing-yao1, CHU Hong-biao1, ZHOU Xi-gen1

(1.Health Science Center, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2.Affiliated Hospital, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000, China)

: To investigate the anti-inflammatory andanalgesic effects ofextract.: The anti-inflammatory animal models were used in researching the effect ofextract on acute and chronic inflammation.The acute models were xylene-induced ear edema and egg white-induced pawedema, while the chronic one was granuloma induced bycotton pellet implantation.Meanwhile, the analgesic effect of the extract was observed by hot plate acetic, acid writhing test and the formalin induced-pain experiment.: Compared with the purified water control group, high and low doses ofalcohol and water extract could significantly inhibit ear edema in mice (< 0.01,< 0.05) and the paw edema in rat (< 0.01).Also, the alcohol and water extract decreased the granuloma of rats (< 0.01).Moreover, the pain thresholdwith hot plate method was significantly increased (< 0.01,< 0.05) compared with the purified water control group and the data before the drugs administration of high and low doses ofalcohol and water extract.And the writhing number was reduced (< 0.01) when contrasted to the purified water control group after extract administration.The alcohol and water extract also significantly inhibited foot pain response at early phase (0 - 5 min) and late phase (15 - 30 min) caused by formalin in mice (< 0.01).However, there were substantial variations in the alcohol extract groups and the same dose of water extract in high and low concentrations (< 0.01,< 0.05).:extract possesses the anti-inflammatory andanalgesic effect, alcohol extract has better effect than water extract.

; alcohol and water extract; intragastric administration; anti-inflammatory;analgesic

1674-8085(2020)01-0086-07

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.01.016

2019-09-19；

2019-10-21

国家科技支撑计划项目子题项目(2012BAC11B02-6)；吉安市科技支撑计划项目(吉市科计字[2014]4号)；

全国中药资源普查项目(财社[2018]43号)

*梁生林(1962-)，男，江西吉安县人，教授，主要从事中草药药理及毒理研究(E-mail: slliang1962@163.com);

钟卫华(1976-)，女，江西吉安人，副主任医师，主要从事B超临床工作(E-mail: 269568714@qq.com);

李庆耀(1965-)，男，江西吉安人，讲师，主要从事中草药药理研究(E-mail: 506877424@qq.com);

褚洪标(1969-)，男，河南商丘人，副教授，博士，主要从事天然药物化学研究(E-mail: hongbiaochu@163.com);

周细根(1972-)，男，江西吉水人，副教授，主要从事中草药药理及毒理研究(E-mail: xgzhou1972@163.com).