复合免疫增强剂对金鳟非特异性免疫力的影响

张振国，钱红，刘克明，罗璋，尤宏争，郝爽，李楠，冯守明

（1.天津市水产研究所，天津 300221；2.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300400）

金鳟体色金黄，肉质鲜美，具有一定的观赏价值，1996 年黑龙江水产研究所从日本引进发眼卵，成功突破了金鳟亲鱼育成及人工繁育等技术[1]，现已成为我国鳟养殖的重要品种。金鳟属于冷水性鱼类，最适养殖水温为12～18℃，主要在东北以及新疆、甘肃、青海等地养殖，北京山区也有较大规模的养殖。金鳟的抗病力较强，但随着金鳟的养殖规模增加，养殖密度不断提高，病害也频繁发生，尤其是传染性造血器官坏死病、弧菌病、细菌性鳃病、细菌性肾病、水霉病和小瓜虫等疾病[2,3]。长期以来鱼病防治主要还是使用抗生素和化学药物，药物残留和食品安全问题日益严峻。目前免疫增强剂的研究应用较多，但多见于单一的种类，复合免疫制剂研究较少，仅有其对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei[4]、刺参Apostichopus japonicus[5]、德国镜鲤Cyprinus carpio specularis[6]以及大菱鲆Scophthalmus maximus和血鹦鹉Cichlasoma var.[7]的非特性免疫力的研究。

本实验中使用的复合免疫增强剂主要成分是酵母多糖、大黄、黄芩、黄柏以及维生素类，经过科学合理的比例配制而成，具有无毒无害无药物残留的优点。复合免疫增强剂首次在冷水鱼上研究应用，对冷水鱼养殖中细菌病预防具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验金鳟体质量为（98.6±5.3）g，采自北京市水产科学研究所延庆冷水鱼基地。养殖试验在天津市水产研究所循环水系统中进行，每个水族缸里饲养36 尾，水温控制在（13±1）℃，溶氧保持在9.0 mg/L 以上，pH7.5 左右，氨氮浓度小于0.01mg/L。每天9:00 和16:00 投喂两次饲料，驯化1 周正常摄食后开展试验。

1.2 方法

试验分3 个实验组，在基部饲料中分别添加0.5%、1%和2%复合免疫增强剂和1 个不添加复合免疫增强剂的对照组，每组36 尾鱼。试验开始后第1、2、3 周和第4 周采血，每组采4 尾鱼，采血部位为尾静脉，血液4℃过夜，3000r/min 离心后取上清，收集血清，采用上海纪宁实业有限公司的试剂盒测定血清中溶菌酶（LYS）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性及补体C3 的含量。

投喂4 周后，采用浓度为3×108cfu/mL 的杀鲑气单胞菌进行攻毒试验。每尾鱼注射0.2mL，统计各实验组14d 内死亡情况，按下式计算免疫保护率：免疫保护率=（1-实验组发病率/对照组发病率）×100%。

1.3 数据统计及分析

试验数据用平均数±标准差来表示，采用SPSS13.0 进行单因素方差分析，当差异显著时（P＜0.05），采用LSD 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 对溶菌酶含量的影响

投喂非特异性免疫制剂对金鳟血清中溶菌酶含量的测定和标准曲线中R2=0.998，数据结果有效（图1）。由图2 可知，复合免疫增强剂添加量为0.5%时，第1 周金鳟血清中LYS 活性即达到最高值（5.35±0.09）U/mL，一直持续到第4 周（5.03±0.73）U/mL；当复合免疫增强剂添加量到1.0%时，金鳟血清中LYS 活性随投喂时间延长先升高后降低，第2周达到最高值（5.42±0.38）U/mL，第4 周降低到（4.00±0.20）U/mL；当复合免疫增强剂添加量在2.0%时，金鳟血清中LYS 活性随投喂时间呈现先升高后降低趋势，在第2 周达到最高值（5.31±0.40）U/mL，第3 周降至（4.12±0.07）U/mL，可能添加量太高出现了免疫疲劳，第4 周为（4.62±0.37）U/mL，与对照组无显著性差异（P＜0.05）（图2）。

2.2 对超氧化物气化酶活性的影响

投喂非特异性免疫制剂对金鳟血清中超氧化物气化酶活性的测定和标准曲线的R2=0.994，数据结果有效（图3）。

由图4 可知，当复合免疫增强剂添加量在0.5%时，金鳟血清中SOD 活性随投喂时间升高，在第2周达到较高值（167.17±6.11）U/mL，第3 周时降至（142.00±3.04）U/mL，第4 周时（167.83±4.64）U/mL；第3 周低于第2 周和第4 周，可能是实验误差所致。当复合免疫增强剂添加量为1.0%时，金鳟血清中SOD 活性随投喂时间延长先升高后降低，第2 周达最高值（152.16±3.88）U/mL，第4 周降至（136.00±4.77）U/mL；当复合免疫增强剂添加量为2.0%时，金鳟血清中SOD 活性随投喂时间先升高后降低，在第2 周达到最高值（151.00±4.82）U/mL，第3 周降至（124.67±10.49）U/mL，可能添加量太高出现了免疫疲劳，第4 周为（133.17±1.61）U/mL，与对照组无显著性差异（P＜0.05）（图4）。

2.3 对补体C3 含量的影响

投喂非特异性免疫制剂对金鳟血清中补体C3含量的测定和标准曲线R2=0.993，数据结果有效（图5）。

由图6 可知，当复合免疫增强剂添加量在0.5%时，金鳟血清中C3 补体含量随投喂时间延长先升高后降低，第2 周达到较高值（102.67±3.41）μg/mL，第4 周时降为（92.91±3.12）μg/mL，但仍高于对照组的（78.08±6.79）μg/mL；当复合免疫增强剂添加量为1.0%时，金鳟血清中SOD 含量随投喂时间先升高后降低，第2 周达到最高值（105.58±2.02）μg/mL，第3 周降低到（96.00±1.73）μg/mL，第4 周与第3 周持平，但仍高于对照组（P＜0.05）；当复合免疫增强剂添加量为2.0%时，金鳟血清中补体C3 含量随投喂时间延长先升高后降低，第2 周达到最高值（119.25±6.95）μg/mL，第4 周降为（94.67±1.84）μg/mL，但仍高于对照组（P＜0.05）（图6）。

2.4 免疫保护率

由表1 可知，对照组在注射杀鲑气单胞菌14d内死亡率为80%，而各实验组的死亡率较对照组有所降低，其中0.5%实验组免疫保护率达到37.5%。

表1 金鳟摄食不同含量复合免疫增强剂的饲料后死亡率统计Tab.1 The statistics of mortality rate in golden trout（Oncorhynchus mykiss）fed diets containing various doses of compound immunostimulant

3 讨论

3.1 复合免疫增强剂对金鳟血清中溶菌酶活性的影响

溶菌酶主要存在于鱼的血清、粘液以及吞噬细胞中，是一种水解酶，具有防御各种病原体的作用，是鱼体非特异性免疫功能主要标志之一。艾春汉[8]等研究表明：黄芪、五味子、党参等中草药能显著提高鲫Carassius auratus 血清中溶菌酶的活力。罗璋[9]等研究表明，酵母细胞壁提升了斑点叉尾Ictalurus punctatus 溶菌酶的活性，增强了抗嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 感染的能力。胡兵[10]等发现添加0.05%黄芪多糖投喂异育银鲫30d 后，血清溶菌酶活性达到最大值。胡宗云[11]等报道添加0.2%的硬葡聚糖对草鱼Ctenopharyngodon idellus 溶菌酶活力影响极其显著。王荻[12]等研究显示复方中草药显著提高了施氏鲟Acipenser schrenckil 血浆等6种组织中的溶菌酶活力。Aramli 等[13]在饲料中添加0.2%和0.3%的β-葡聚糖，投喂波斯鲟Acipenser persicus 6 周后，可显著提高血清中溶菌酶和总补体（ACH50）的含量。Ai Q 等[14]在饲料中添加0.09%和0.18%的β-葡聚糖，投喂大黄鱼Pseudosciaena crocea 8 周后，血清中溶菌酶含量从对照组的97.00U/mL 分别提高到118.61U/mL 和131.87U/mL。本试验中的金鳟在投喂含0.5%免疫复合增强剂的饲料1 周后血清中溶菌酶的含量显著高于对照组，一直持续到第3 周和第4 周后溶菌酶的含量略有降低，高于对照组，但差异不显著。

3.2 复合免疫增强剂对金鳟血清中超氧化物歧化酶的影响

超氧化物歧化酶（SOD）是鱼体非特异性免疫功能的重要指标。SOD 活性变化反映了机体清除自由基的能力，可增强吞噬细胞的防御能力和机体的免疫功能。胡兵等[10]研究发现，黄芪多糖可显著提高异育银鲫体内的SOD 活性。李赫等[15]发现投喂含黄芪多糖、枸杞多糖和金丝桃素的饲料使草鱼血清SOD 活性显著高于对照组。李梅芳等[16]给大黄鱼投喂不同中草药饲料28d 内，血清溶菌酶和超氧化物歧化酶活性随投喂时间延长而升高。本试验中，金鳟摄食含0.5%免疫复合增强剂的饲料1 周后血清中超氧化物歧化酶的活性显著高于对照组，维持到第2 周，第3 周后降低，高于对照组，但差异不显著。

3.3 复合免疫增强剂对金鳟血清中补体C3 含量的影响

补体系统是鱼体免疫的重要组成部分，主要功能是促进吞噬和溶解靶细胞。由补体介导的溶裂途径清除病原是先天免疫反应的重要效应机制。樊英等[17]将黄芪多糖提取物来注射到刺参体腔，不同程度提高了刺参血清补体C3 的含量，起到了预防疾病的作用。盛竹梅等[18]将复方中草药制剂投喂给黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco 30d 后，黄颡鱼血清中补体C3 和C4 的含量显著高于对照组。孟兆娜等[19]投喂复方中草药14d 和28d 后镜鲤幼鱼血清补体C3 含量显著高于对照组。本试验中，第1 周各实验组金鳟血清中补体C3 的含量便开始显著高于对照组，一直持续到第4 周，与对照组之间仍具有显著性差异。

3.4 复合免疫增强剂对金鳟抗病力的影响

在饲料中添加0.5%的复合免疫增强剂4 周后，金鳟感染杀鲑气单胞菌的概率降低；进一步加大复合免疫增强剂的添加量，效果反而会降低，可能是出现了免疫疲劳。长期口服免疫增强剂会降低鱼类免疫水平，可能是鱼体的一种负反馈系统，使得免疫水平回落到最初的水平[20,21]。因此，投喂该复合免疫增强剂剂量不宜过高、时间也不宜过长，两到三周比较合适，避免出现免疫疲劳。间隔一段时间可继续投喂，使得免疫水平长期处于较高水平。

小结

目前，危害金鳟的疾病时有发生，使金鳟养殖业损失较大。本研究显示，投喂0.5%复合免疫增强剂可有效提高金鳟血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶的活性、补体C3 的含量，增强了鱼体对细菌病的抵抗力。