血清微小RNA Let-7a表达水平对儿童哮喘诊断及严重程度评估的价值

李 燚，李 蓉，贾 可，赵 轲

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院：1.儿科；2.胸外科，湖北武汉 430030)

哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病，其特征是气流可逆性阻塞、支气管反应过度，临床表现为反复发作的喘息、咳嗽和呼吸困难[1]。哮喘患者的免疫反应改变可归因于遗传和表观遗传改变。微小RNA(miRNA)是短链非编码的RNA分子，高度保守并通过靶向mRNA致mRNA降解、切割或抑制蛋白质翻译来控制基因表达过程，参与细胞分化、增殖、凋亡和细胞因子调节[2]。在过敏性气道疾病中，miRNA的作用主要通过影响一般炎症和组织反应细胞因子表达而实现[3]。

miRNA Let-7属于由12个基因组成的高度保守的miRNA家族，其编码9种不同的RNA分别命名为Let-7a至let-7i，let-7家族在肺脏中表达水平最为丰富[4]。Let-7a通过直接靶向白细胞介素(IL)-13转录物的3′UTR来抑制IL-13表达，调节IL-13分泌并由此调节气道过敏性炎症[5]。IL-13主要由Th2细胞分泌，是参与过敏性炎症和哮喘的细胞分子[6]。儿童哮喘状态下血清IL-13 水平增加，参与支气管高反应性、几丁质酶上调等病理生理过程[7]。尽管如此，哮喘儿童血浆Let-7a 表达水平尚无报道，本研究旨在探讨儿童哮喘患者血浆Let-7a的表达水平及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入2017年3月至2018年3月于本院收治的过敏性哮喘儿童90例为哮喘组，其中男41例，女49例，年龄6～10岁。哮喘的诊断标准和严重程度参照全球哮喘倡议指南(GINA)[8]。并根据哮喘的严重程度分为轻度(41例)、中度(28例)、重度(21例)3个亚组。纳入标准：(1)患者出现反复喘息和呼吸困难且诊断为哮喘；(2)吸入β2激动剂治疗，肺功能检测第1秒用力呼气容积(FEV1)与吸入前相比增加12%；(3)皮肤点刺试验阳性。排除标准：(1)患有心、肝和肾脏疾病；(2)患有与胸闷、剧烈呼吸和(或)咳嗽相关的其他肺病。根据肺功能检查结果，采用FEV1水平评估哮喘的严重程度：轻度(FEV1>80%)、中度(FEV1 60%～80%)、重度(FEV1<60%)哮喘。选择同期年龄和性别相匹配的没有呼吸系统疾病或慢性病史的健康儿童90例为健康对照组，其中男40例，女50例，年龄6～10岁。本研究通过本院伦理委员会批准，并获得所有参与研究儿童父母的知情同意。

1.2肺功能评估 使用便携式儿科肺活量计(Masterlab Jaeger，Wurzberg，Germany)评估哮喘组中儿童的FEV1和用力肺活量(FVC)。肺功能测试的结果以预测的百分比表示。

1.3患者血液样本收集 在完全无菌条件下从参与的儿童收集外周血样品(4 mL)并分成两部分：将2 mL收集至乙二胺四乙酸管中，然后将管离心10 min(1 900×g，4 ℃)，并将血浆小心地转移到不含RNase的管中，然后再次离心10 min(12 000×g，4 ℃)。将另一部分(2 mL)在室温下凝结30～60 min，然后离心10 min(1 000×g)以制备血清。将血浆和血清样品储存在-80 ℃直至进一步分析。

1.4测量血清IL-13水平 使用酶联免疫吸附试验测定商业试剂盒(Bender MedSystems，Heidelberg，Germany)按照制造商的说明测定人血清中的IL-13水平，评估灵敏度为1.50 pg/mL。

1.5实时荧光定量PCR检测血清Let-7a表达水平 使用miRNeasy血清/血浆试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从血浆样品中提取总RNA。分光光度计通过测量260和280 nm处的吸光度来确认提取的RNA纯度和质量。根据制造商的说明书，使用miScript Ⅱ RT试剂盒(Qiagen，Germany)通过反转录反应合成cDNA，并将cDNA储存在-80 ℃直至使用。使用SYBR Green测定试剂盒(mi-ScriptSYBR®GreenPCR Kit和miScript Primer assay(Qiagen，Valencia，CA)在Stratagene Mx3000p系统(实时PCR系统，Agilent Technologies，Germany)中进行实时荧光定量PCR。反应混合物以20 μL的总体积进行，含有4 μL cDNA(100 ng/mL)、300 nmol/L引物和10 μL SYBR Green Master Mix，并用无核酸酶水完成至20 μL。热循环条件如下：在95 ℃下初始变性5 min，然后在94 ℃变性40 s,退火15 s，并在72 ℃延伸10 s。选择管家miRNA SNORD68(miScript PCR control，Qiagen，Germany)作为内部对照并采用2-ΔΔCt方法计算Let-7a的表达水平。Let-7a的实时荧光定量PCR的特异度引物：正向5′-GCA GTG AGG TAG TAG GTT G-3′；反向5′-GGT CCA GTT TTT TTT TTT TTT TAA CTA TAC-3′。管家小RNA(SNORD-68)用作内部对照，其引物序列为：正向5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；反向5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。每个病例样本独立重复测量3次，取平均值作为该样本最终Let-7a表达水平。

2 结 果

2.12组一般临床资料比较 哮喘组与健康对照组在年龄和性别上差异无统计学意义(P>0.05)。2组研究对象哮喘家族史、肺功能检测(FEV1和FVC)之间差异有统计学意义(P<0.05)；哮喘组儿童血清IL-13水平显著高于健康对照组(P=0.000)，哮喘组儿童Let-7a表达水平显著低于健康对照组(P=0.000)。见表1。

表1 哮喘组与健康对照组一般临床资料比较

2.2不同严重程度的哮喘患儿血清IL-13和Let-7a表达水平比较 外周血中IL-13水平随哮喘严重程度显著增加(P=0.000)，血清Let-7a表达水平随哮喘严重程度显著下降(P=0.000)。见表2。

2.3血清Let-7a表达水平的诊断价值 当最佳临界值为2.09时，血清Let-7a诊断哮喘儿童的AUC为0.92(95%CI：0.87～0.95，P=0.001)，灵敏度和特异度分别为85.0%和90.0%；当最佳临界值为1.60时，Let-7a区分重度和中轻度哮喘的AUC为0.80(95%CI：0.68～0.92，P=0.001)，灵敏度和特异度分别为75.0%和93.5%。见图1。

表2 血清IL-13和Let-7a表达水平与哮喘严重程度的关系

注：A表示哮喘；B表示重度哮喘。

图1 Let-7a表达水平的ROC 曲线

2.4Let-7a与IL-13、FEV1、FVC相关性分析 Pearson相关分析显示，Let-7a的表达水平与IL-13水平呈负相关(r=-0.31，P=0.001)，见图2A；Let-7a的表达水平与FEV1 呈正相关(r=0.270，P=0.004)，与FVC呈正相关(r=0.412，P=0.002)，见图2B、C。

注：A表示Let-7a和IL-13水平相关性;B表示Let-7a和FEV1之间相关性;C表示Let-7a和FVC之间相关性。

图2 Let-7a与IL-13、FEV1、FVC相关性分析

3 讨 论

哮喘是严重影响小儿身心健康的常见呼吸道疾病，儿童哮喘的患病率及死亡率均有上升趋势，我国存在1 000多万哮喘患儿[9]。探讨儿童哮喘相关血清非侵入性标志物对哮喘诊断和疾病严重程度的评估具有重要意义[10]。

miRNA是一大类小的调节分子，在各种细胞生命活动中发挥重要作用[11]。在哮喘发病过程中，miRNA通过调节Th2的存活、激活、增殖、分化和发育来控制过敏性免疫应答的强度[12]。本研究发现哮喘儿童Let-7a表达水平显著性低于健康对照儿童，提示在儿童哮喘患者中，Let-7a表达受到抑制。随着哮喘严重程度增加，血清Let-7a表达水平呈下降趋势。ROC曲线分析表明，Let-7a表达水平可区分哮喘和健康儿童，研究结果提示血清Let-7a表达水平可作为哮喘患者诊断的生物标志物。ROC曲线分析显示，血清Let-7a表达水平可以预测哮喘严重程度。本研究报道与文献结果一致，哮喘患者血清中Let-7a表达水平降低[13]，同时在哮喘患者支气管肺泡灌洗液中分离出来的气道上皮细胞中Let-7a表达水平也下降[14]。有文献报道，与患有慢性阻塞性肺疾病的患者和健康对照组患者相比，哮喘患者呼出气冷凝物中Let-7a miRNA表达较低[15]。通过miRNA微阵列分析检查哮喘个体的支气管肺泡灌洗液，发现Let-7a表达下调[16]。与轻度哮喘患者和健康对照组相比，严重哮喘患者的支气管活检发现气道上皮细胞内Let-7a表达水平降低[17]。

本研究通过酶联免疫吸附试验法分析儿童哮喘患者血清IL-13水平，发现儿童哮喘患者血清IL-13水平显著高于健康对照儿童，且随着疾病严重程度增加而增加。嗜酸性粒细胞增多和Th2细胞因子(IL-13、IL-4和IL-5)分泌增加是哮喘患者气道高反应性特征[18]。本研究发现，Let-7a表达水平与IL-13水平呈负相关，与FEV1和FVC呈正相关。有文献报道，miRNA Let-7a可通过靶向性结合IL-13的信使RNA 3′UTR端，靶向抑制信使RNA翻译过程，进而抑制IL-13的表达，降低IL-13在气道上皮中的水平，减少气道炎症和气道高反应性，具有阻止肺纤维化功能，其研究还发现哮喘小鼠模型中Let-7a表达在哮喘中的抗炎作用，可降低哮喘小鼠外周血T细胞诱导IL-13分泌[5]。在癌症患者和特发性肺纤维化患者中也提出了Let-7a的抗炎作用[19]。本研究发现，儿童哮喘患者血清Let-7a表达水平与IL-13水平呈负相关，提示Let-7a表达可能通过抑制IL-13 产生而发挥抗炎和降低高反应性作用。Let-7a表达水平与肺功能参数(FEV1和FEV)呈正相关，确切原因尚不清楚，猜测可能与Let-7a表达水平降低气道高反应性相关，需要进一步研究。

4 结 论

本研究结果显示，哮喘儿童外周血中Let-7a表达水平显著下降，其水平与疾病严重程度、IL-13水平和肺功能参数呈相关性。Let-7a可用作哮喘诊断和严重程度的非侵入性血清学生物标志物。