食管癌EC9706细胞中miR-149 rs140584242多态性对DNA聚合酶β表达的影响

张晓红,张文文，臧文巧，赵国强

1)郑州卫生健康职业学院基础医学系 郑州 450005 2)郑州大学基础医学院免疫学系 郑州450001

DNA聚合酶β(polymerase β，polβ)广泛存在于哺乳动物细胞核内，是DNA聚合酶家族的主要成员，在DNA碱基的切除修复过程中发挥重要作用[1]，正常情况下在细胞和组织中呈现稳定低水平表达状态[2-3]。polβ异常表达和突变与多种肿瘤关系密切。在食管癌组织中polβ多呈现异常高表达[4-5]；polβ高表达与食管癌化疗敏感性也存在一定关系，表现为polβ表达水平越高癌细胞对顺铂类药物敏感性越差[6]。课题组前期实验[7]结果证实polβ是miR-149的靶基因，miR-149负调控食管癌细胞polβ表达水平。rs140584242多态性位于miR-149的转录区，该多态性可造成miR-149种子区1个碱基的改变。有研究[8]报道miRNA种子区的碱基改变可以影响miRNA对靶基因的调控。为此，本研究采用表面等离子共振实验、双荧光素酶报告实验和Western blot等，探讨食管癌EC9706细胞中rs140584242多态性对miR-149调控polβ表达的影响。

1 材料与方法

1.1主要材料食管癌EC9706细胞、人胚肾293T细胞购于上海中科院细胞库；Trizol、LipofectamineTM2000购于Invitrogen公司；Western blot所用polβ、β-actin和酶标抗体购于Santa Cruz公司；BCA蛋白检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所；胎牛血清、RPMI 1640培养液购于Gibco公司；pmirGLO、双荧光素酶检测试剂盒购于Promega公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；野生型miR-149、多态性miR-149(rs140584242 G→A突变)和miRNA阴性对照(miR-NC)由上海吉玛公司合成；表面等离子共振实验用SA芯片、表面等离子共振检测仪Biacore T200购于GE公司。

1.2多态性miR-149与polβ3’UTR结合力的检测使用miRbase(www.mirbase.org)和UCSC(genome.ucsc.edu)数据库对野生型、多态性miR-149与polβ 3’UTR的结合位点进行预测分析。采用表面等离子共振实验检测多态性miR-149与polβ 3’UTR的结合力。由上海吉玛公司合成带有生物素标记的2种polβ 3’UTR片段： ①野生型polβ 3’UTR片段(WT POLB)。②与miR-149结合区域完全突变的polβ 3’UTR片段(MT POLB)。通过与SA芯片的亲和素结合，将其分别固定在SA芯片不同通道。将miR-NC、野生型miR-149和多态性miR-149分别上机与固定在SA芯片上的WT POLB和MT POLB进行结合解离分析，记录反映结合能力的RU值，详细步骤见Biacore T200操作指南。实验重复3次。

1.3多态性miR-149与polβ3’UTR结合的双荧光素酶报告实验以正常人基因组DNA为模板，分别使用野生型上游引物(5’-AGGCTCGAGTGAGGC CTGTATCCTCCCTGGCAGACACAACCCAATAGGAGT CTTAATTT-3’)、突变型上游引物(5’-AGGCTCGAGTGAGGCCTGTATGGAGGGAGGCAGACACAACC CAATAGGAGTCTTAATTT-3’)和通用的下游引物(5’-CACTCTAGATAATAGTACATGAGGTTTTATTGA C-3’)扩增得到野生型和突变型polβ 3’UTR片段，XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后，重组入pmirGLO，测序鉴定得到野生型和突变型polβ 3’UTR重组报告基因载体(pmirGLO-WT和pmirGLO-MT)。将miR-NC、野生型miR-149和多态性miR-149分别与pmirGLO-WT或pmirGLO-MT共转染入293T细胞，均设5个复孔，培养24 h后收集细胞，使用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。实验重复5次。

1.4EC9706细胞培养、转染和polβ蛋白表达的Western blot检测将EC9706细胞接种于6孔板内，细胞单层贴壁生长于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中常规培养。当EC9706单层细胞生长铺满80%时，使用LipofectamineTM2000包裹，分别将miR-NC、野生型miR-149和多态性miR-149转染入EC9706细胞。转染后继续培养48 h，收集细胞进行polβ蛋白的Western blot检测。提取上述3组细胞中的总蛋白，加入上样缓冲液，煮沸后上样并进行SDS-PAGE电泳。甲醇预处理PVDF膜，电泳结束进行转膜，转膜后用封闭液封闭1 h，TBST洗去封闭液，加一抗(1∶500稀释的鼠抗人polβ)4 ℃孵育过夜。之后用TBST洗涤4次去除一抗，每次6～8 min。加二抗(1∶2 000稀释的酶标山羊抗鼠IgG)4 ℃孵育2 h，然后用TBST洗涤4次去除二抗，每次6～8 min。将ECL发光试剂滴加在PVDF膜上，Western blot成像系统曝光拍照，用Image J量化分析。polβ蛋白相对表达量=polβ蛋白条带灰度值/内参β-actin条带灰度值。实验重复3次。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0进行统计学处理。不同组间RU值、荧光素酶活性、polβ蛋白表达水平的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1多态性miR-149与polβ3’UTR结合的预测结果见图1。可知，野生型miR-149与polβ 3’UTR存在7碱基互补的结合区，rs140584242多态性则使miR-149的互补碱基减少1个。

图1 野生型、多态性miR-149与polβ 3’UTR种子区结合预测结果

2.2多态性miR-149与polβ3’UTR的结合力检测结果见表1。3种miRNA与MT POLB结合的RU值比较，差异无统计学意义，且RU值均很小，说明这3种miRNA与突变型polβ 3’UTR几乎没有结合力。多态性miR-149和miR-NC组与WT POLB结合的RU值低于野生型miR-149，说明多态性miR-149与野生型polβ 3’UTR几乎没有结合力。

表1 3种miRNA与WT POLB和MT POLB结合的RU值比较

*:与其他2组比较，P<0.05

2.3双荧光素酶报告实验结果见表2。与pmirGLO-MT共转染的3组293T细胞的荧光素酶活性比较，差异无统计学意义。而多态性miR-149与 pmirGLO-WT共转染细胞的荧光素酶活性和野生型miR-149相比,均明显升高，说明多态性miR-149不能与野生型polβ 3’UTR结合。

表2 双荧光素酶报告实验结果

*:与其他2组比较，P<0.05

2.4polβ蛋白表达的Western blot检测结果3组EC9706细胞中polβ的表达见图2、表3。与miR-NC组相比,野生型miR-149组细胞中polβ蛋白表达水平降低，而多态性miR-149组polβ蛋白表达水平未降低。

1：miR-NC组；2：野生型miR-149组；3：多态性miR-149组

组别npolβ蛋白相对表达量miR-NC组30.847±0.081野生型miR-149组30.447±0.067*多态性miR-149组30.830±0.060

F=31.636，P<0.001；*:与其他2组比较，P<0.05

3 讨论

miRNA的种子区通常由7～8个核苷酸组成，该种子区与靶基因的3’UTR互补，使miRNA与靶基因结合，阻止后者的翻译，发挥负调控靶基因表达的作用。种子区长度通常只是成熟miRNA长度的1/3左右,因此，miRNA与靶基因的结合并不牢固，在细胞内部表现不很稳定。rs140584242多态性为单核苷酸G→A的改变，可导致多态性miR-149种子区与靶基因polβ 3’UTR的结合区由7个核苷酸互补减少为6个，直观表现为结合区缩小。本研究中表面等离子共振实验发现，多态型miR-149与WT POLB的结合力远小于野生型miR-149，证实这样1个碱基的种子区减小可以造成多态性miR-149与靶基因polβ 3’UTR结合力的大幅度降低，导致二者基本上不结合；双荧光素酶报告实验结果说明，多态性miR-149不能与野生型polβ 3’UTR结合；Western bolt实验结果说明多态性miR-149不能有效抑制食管癌EC9706细胞中polβ的表达。本研究结果有力地说明rs140584242 G→A可大幅度降低miR-149与靶基因polβ 3’UTR的结合能力，导致其对polβ表达的负调控作用大幅度减弱或失效。

有报道[8]，位于种子区的单核苷酸多态性rs12402181(A/G)可使miR-3117-3p与其靶点之间的识别失败，可以异常激活RAS-MSPK途径，从而参与白血病的发生。miR-1614-3p种子区多态性(rs15172520)与鸡生产性状的相关性分析[9]结果显示，单核苷酸多态性与乳腺肌肉剪切力、腿部肌肉失水率、鸡翅质量、肝脏质量、心脏质量、腹部脂肪质量有关。这些报道与本研究都证明miRNA种子区存在单核苷酸多态性，并且这些多态性可造成靶基因调控和生物学性状的变化。事实上还有大量的单核苷酸多态性不存在于miRNA种子区，它们可能影响前体miRNA的二级结构、剪切及成熟miRNA的表达，通过调控下游靶基因，进而影响生物学行为和过程[10-11]。一些位于靶基因3’UTR的单核苷酸多态性也可以造成miRNA与靶基因3’UTR结合力降低或丧失，导致对靶基因的负调控作用减弱或失效[7,12-14]。

本研究明确了食管癌EC9706细胞中多态性rs140584242(G→A)可导致miR-149对polβ表达的负调控作用丧失，为食管癌中miR-149的调控作用研究积累了有益资料。