普罗布考对非对称性二甲基精氨酸诱导的人脑微血管内皮细胞凋亡的作用

王艮卫,刘 展,马继伟,周文科,牛光明,常克亮,娄金峰

1)郑州大学第二附属医院神经外科 郑州 450014 2)新乡医学院第一附属医院神经外科 河南卫辉 453100

缺血性脑血管病的早期病理机制是内皮细胞功能障碍[1]。非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一种超强的内源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂，可引起多种脑血管疾病的内皮功能障碍[2-3]。研究[4]表明，ADMA可增加内皮细胞氧化应激，诱导血管炎症反应，加速脑血管疾病的进程。因此，抑制ADMA诱导的内皮细胞损伤和氧化应激可能是治疗缺血性脑血管损伤的有效方法。已有研究[5]表明，普罗布考可显著抑制促炎细胞因子，抑制自由基介导的炎症反应，提高内皮舒张功能，从而抑制泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块的形成。普罗布考可在体外亨廷顿病模型中调节氧化应激[6]，改善无症状腔隙性脑梗死患者的内皮功能[7]。本研究观察了普罗布考对ADMA诱导的人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)损伤的保护作用，并且分析其在JNK/P38 MAPK信号传导通路中的作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂HBMEC购自北京拜尔迪诊断技术有限公司；RPMI 1640、胎牛血清购自美国Gibco公司；JNK特异性抑制剂SP600125、P38 MAPK特异性抑制剂SB203580和普罗布考购自美国Calbiochem公司；ADMA、Caspase-3检测试剂盒购自美国Sigma公司；增强的化学发光蛋白印迹检测试剂购自美国Pierce公司；DMSO、MTT、抗P38、抗p-P38、抗JNK和抗p-JNK多克隆抗体购自英国Abcam公司；LDH、ROS测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；小鼠抗β-actin单克隆抗体购自上海艾比玛特医药科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠/兔IgG购自美国Santa Cruz公司。

1.2细胞培养和处理将HBMEC培养在含有105U/L青霉素、100 g/L链霉素和体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 ℃用体积分数5%CO2在潮湿的培养箱中培养。每2～3 d更换一次培养基。将生长活跃的第4～6代HBMEC用于实验研究。细胞分组如下。①治疗组：加入30 μmol/L ADMA及普罗布考，其中普罗布考分为10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 4个剂量组。②ADMA组：仅加入30 μmol/L ADMA。③普罗布考组：仅加入10-5mol/L普罗布考。④对照组：不加药物。治疗组细胞处理方法：将细胞在无血清培养基中饥饿处理24 h后用30 μmol/L ADMA进行处理，在ADMA处理前20 min给予普罗布考。普罗布考、ADMA干预细胞时间为24 h[8-9]。以上分组用于测定细胞活性、LDH释放量和脑源性神经营养因子(BDNF);其他指标测定时采用析因设计分为对照组、ADMA组、ADMA+普罗布考组、普罗布考组，ADMA剂量为30 μmol/L，普罗布考剂量为10-5mol/L。实验另设对照组、ADMA组、ADMA+普罗布考组、ADMA+SP600125组、ADMA+SB203580组、普罗布考组，ADMA+SP600125组和ADMA+SB203580组分别用SP600125(10 μmol/L)和SB203580(25 μmol/L)处理1 h，其他处理条件同上。

1.3细胞活性的MTT法检测将各组细胞置于96孔板中并在常规条件下培养至其融合率达80%。然后弃去培养基，每孔加入含有MTT(5 g/L)的新鲜培养基150 μL后培养4 h，每孔加入150 μL DMSO并轻摇10 min以溶解甲瓒。采用酶标仪测定490 nm处的吸光度(A)，细胞活性=加药组A/对照组A×100%。实验设置3个复孔，重复3次。

1.4LDH释放量的比色法测定各组细胞用体积分数0.2%TritonX-100裂解，4 ℃、10 000×g离心2 min，收集上清液，在37 ℃与丙酮酸(0.5 mmol/L，25 μL)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(2 mmol/L，60 μL)共培养15 min，加入NaOH(0.4 mol/L)完成反应。检测530 nm处的A值，采用标准曲线法计算LDH释放量。实验设置3个复孔，重复3次。

1.5细胞中丙二醛(MDA)和BDNF的ELISA法测定取各组细胞，5 000×g离心后收集细胞，加入PBS制成细胞悬液后，采用ELISA法测定MDA、BDNF。实验设置3个复孔，重复3次。

1.6细胞中ROS释放量的DCFH-DA法测定各组细胞用PBS洗涤3次后，加入DCFH-DA 10 μmol/L在37 ℃培养6 h。然后将细胞置于微量滴定板的孔中应用荧光酶标仪检测各孔荧光强度，检测条件为激发波长480 nm、发射波长530 nm，ROS释放量以平均荧光强度表示。实验设置3个复孔，重复3次。

1.7细胞中bax、bcl-2、内皮型NOS(eNOS)mRNA表达的RT-PCR法测定各组细胞提取并纯化总RNA，反转录。bax、bcl-2、eNOS引物序列见表1，β-actin作为内参。PCR条件： 94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃聚合30 s，35个循环。所得PCR产物在15 g/L琼脂糖凝胶上进行分离，并在透照仪下用溴化乙锭显色。目的mRNA相对表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值。实验重复9次。

表1 bax、bcl-2、eNOS及内参引物序列

1.8细胞中Caspase-3蛋白活性的比色法测定收集各组细胞并用冷PBS洗涤，于裂解液中冰悬15 min。将裂解物以10 000×g离心20 min，收集上清液并计算蛋白浓度。取细胞提取物30 μg与200 μmol/L乙酰基Asp-Glu-Val-Asp-p-硝基苯胺在37 ℃培养2 h后在405 nm处测定A。Caspase-3活性=加药组A/对照组A。实验设置3个复孔，重复3次。

1.9细胞中p-JNK、JNK、p-P38、P38蛋白的免疫印迹法测定各组细胞在细胞裂解缓冲液中裂解，采用Bradford方法测定蛋白浓度。将20～30 μg蛋白加载到120 g/L SDS-PAGE凝胶上，并印迹到聚偏二氟乙烯膜上。将膜用25 g/L脱脂牛奶在37 ℃封闭1 h，加入一抗(JNK、p-JNK、P38、p-P38均按1∶1 000稀释，内参β-actin按1∶2 000稀释)4 ℃培养过夜，加入二抗(均按1∶2 000稀释)培养1 h后，采用化学发光法检测蛋白条带灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。实验重复9次。

1.10统计学处理采用SPSS 19.0进行数据分析。不同组间HBMEC细胞活性、LDH释放量、BDNF、p-JNK/JNK、p-P38/P38的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；MDA，ROS释放量，bcl-2、bax、eNOS mRNA相对表达量，Caspase-3蛋白活性的比较均采用析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.17组细胞活性、LDH释放量、BDNF的比较结果见表2。由表2可知，与对照组相比，ADMA组LDH释放量升高，细胞活性和BDNF降低；与ADMA组相比，普罗布考组和各ADMA+普罗布考组LDH释放量降低，细胞活性和BDNF升高。

表2 7组细胞活性、LDH释放量、BDNF比较

*：与对照组相比，P<0.05；#：与ADMA组相比，P<0.05

2.24组细胞MDA,ROS释放量,bcl-2、bax、eNOS mRNA相对表达量,Caspase-3蛋白活性的比较结果见表3。由表3可知，ADMA主效应使MDA、ROS释放量、bax mRNA相对表达量、Caspase-3蛋白活性升高，bcl-2、eNOS mRNA相对表达量降低；普罗布考主效应使MDA、ROS释放量、eNOS mRNA相对表达量升高，bcl-2、bax mRNA相对表达量及Caspase-3蛋白活性降低；且ADMA与普罗布考存在交互作用。

表3 4组细胞MDA,ROS释放量,bcl-2、bax、eNOS mRNA相对表达量,Caspase-3蛋白活性的比较

2.36组细胞p-JNK/JNK、p-P38/P38的比较结果见表4。由表4可知，与对照组相比，ADMA组、ADMA+普罗布考组、ADMA+SP600125组、ADMA+SB203580组p-JNK/JNK、p-P38/P38升高；与ADMA组相比，ADMA+普罗布考组p-JNK/JNK、p-P38/P38降低。

表4 6组细胞p-JNK/JNK、p-P38/P38的比较

*：与对照组相比，P<0.05；#：与ADMA组相比，P<0.05

3 讨论

有证据[10]表明，某些心血管疾病的内皮功能障碍与血浆ADMA水平升高有关。因此，保护内皮细胞免受ADMA诱导的损伤可能是缺血性脑血管疾病的有效治疗方法。最近的研究[11-12]表明，普罗布考可以在体内预防次氯酸盐诱导的内皮功能障碍，并在AD小鼠模型中预防血脑屏障功能障碍。

LDH是活细胞浆内酶，细胞膜通透性变化时，细胞会将LDH释放到培养液中，LDH释放增加。BDNF能抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，BDNF降低提示细胞抑制氧化应激诱导的细胞凋亡的能力下降，细胞更容易受损。在本研究中，用30 μmol/L ADMA处理HBMEC后，细胞LDH释放增加，细胞活性和BDNF降低，这与之前的研究[5]结果相符。

近年来ROS被认为是细胞内信号分子，且在细胞凋亡中起重要作用。已有报道[13]指出，ADMA通过内皮细胞中“NOS活性的解偶联”增加细胞内ROS的产生。该研究结果显示， ADMA可显著增加细胞内ROS生成，并且下调HBMEC中eNOS的表达。作者还发现普罗布考预处理显著降低了ROS的产生，增强了eNOS mRNA的表达。MDA是脂质过氧化的一个重要指标。结果显示ADMA显著提高了体外培养的HBMEC中MDA的水平；而普罗布考显著降低了由ADMA诱导的MDA形成。提示普罗布考通过抗氧化或调节内源性抗氧化系统保护内皮细胞免受ADMA诱导的细胞毒性。

Bax/Bcl-2家族由许多重要的凋亡调节因子组成，Bax/Bcl-2表达的改变可影响细胞凋亡过程。Caspase-3主要处于细胞凋亡反应的下游，是蛋白水解级联反应的核心组成部分，在细胞凋亡过程中起着关键作用[14]。该研究结果显示，经ADMA处理后HBMEC中Caspase-3蛋白活性和bax mRNA表达上调，bcl-2 mRNA表达下调。普罗布考预处理可抑制bax mRNA的表达和Caspase-3蛋白活性，提高bcl-2 mRNA的表达，从而证实了普罗布考对ADMA诱导的细胞凋亡的保护作用。

据报道[14]，P38 MAPK的激活可诱导多种细胞凋亡。先前的研究[10]显示，ADMA通过P38 MAPK/Caspase-3依赖信号通路诱导内皮细胞凋亡。此外，据报道[15]JNK磷酸化在细胞凋亡中起重要作用。作者应用JNK特异性抑制剂SP600125和P38 MAPK特异性抑制剂SB203580处理细胞，结果显示，ADMA可诱导JNK和P38 MAPK的磷酸化，而普罗布考预处理可抑制JNK和P38 MAPK信号的激活，正如用JNK和P38 MAPK特异性抑制剂处理的一样。以上结果说明，普罗布考可以调节ADMA处理的HBMEC中JNK/P38 MAPK信号通路，这可能是普罗布考诱导的保护作用的潜在机制。之前的研究[5]显示，与对照组相比，普罗布考对内皮细胞不产生明显的影响。本研究中析因分析结果显示普罗布考主效应对HBMEC各指标均产生影响，与上述研究[5]结果不符，需进一步研究证实。

总之，该研究结果证实了普罗布考对ADMA诱导的HBMEC损伤有保护作用，其作用机制为促进细胞活性、增加BDNF释放、清除ROS、减少脂质氧化和抑制细胞凋亡。此外，普罗布考可能是通过调节JNK/P38 MAPK信号通路发挥其保护作用。