PD-1在非小细胞肺癌肿瘤细胞表达水平及预后的临床意义

李 婷，刘金燕，刘朝俊，李洁瑶，陈壬寅，王丽萍，张 毅

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052 3)河南省肿瘤免疫和生物治疗重点实验室 郑州 450052 4)郑州大学第一附属医院病理科 郑州 450052

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在世界范围恶性肿瘤中均居首位[1]。肺癌传统治疗方法包括手术、放疗和化疗，尽管近年来肺癌的治疗效果不断提高，但5 a生存率仍不足15%[2]。肿瘤免疫治疗的发展为肿瘤的治疗提供了新的方法，其中程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)/程序死亡性配体1(programmed cell death ligand-1, PD-L1)单抗在临床肿瘤治疗中显示出良好的疗效[3]。有研究[4]结果显示，PD-1主要表达于活化或耗竭的T细胞表面，属于B7-CD28家族成员。PD-1有PD- L1和PD-L2两种配体。肿瘤微环境中，肿瘤细胞高表达PD-L1，可与PD-1结合来抑制T细胞增殖和细胞因子的分泌，从而发生免疫逃逸[5]。有研究[6]发现PD-1不仅表达于T细胞，也在其他各种免疫细胞表面表达，并发挥免疫调解作用。近年来有研究[7-9]发现PD-1也表达在某些肿瘤细胞表面，例如黑色素瘤起始细胞通过表达PD-1，活化mTOR信号通路，进而促进肿瘤细胞生长。也有文献[10-11]报道，BRAF和MEK抑制剂联合治疗促进黑色素瘤细胞PD-1的表达，增强PD-1单抗的抗肿瘤作用，为BRAF和MEK抑制剂联合PD-1单抗治疗提供了理论基础。在肝癌的研究[12-13]中，肝癌患者的癌细胞及肝癌细胞系中均表达PD-1，且PD-1的表达促进了肿瘤细胞的生长。有文献[14]报道，PD-1在非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤细胞表面表达。然而，目前尚无大样本研究NSCLC患者肿瘤细胞PD-1的表达及其与患者的临床病理参数和预后的关系。因此，本研究采用免疫组化方法检测138例NSCLC患者肿瘤细胞表面PD-1的表达水平，揭示PD-1在肺癌患者中的表达模式，并探究其与NSCLC患者临床病理参数及预后的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象选取2013年1月至2018年4月郑州大学第一附属医院收治的且病理诊断证实为NSCLC的患者，共138例。患者手术前均未接受放、化疗及其他抗肿瘤药物治疗。收集入选患者的临床资料，包括：年龄、性别、病理类型、淋巴结转移情况和TNM分期(肺癌TNM分期均依据第8版国际肺癌TNM分期标准)。其中男88例，女50例；患者年龄33～83(60.1±10.9)岁；病理分型：腺癌83例，鳞癌55例；TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期20例，Ⅲ期36例，Ⅳ期52例。

1.2治疗方案对于早期(Ⅰ、Ⅱ期)NSCLC患者，行根治性手术治疗；Ⅰb到Ⅱ期高危人群加以辅助化疗。对于晚期NSCLC患者，行放、化疗或化疗药联合治疗。常用化疗药有：顺铂、紫杉醇、吉西他滨等。部分患者使用靶向药物，如EGFR突变患者行EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗；ALK重排阳性患者行ALK抑制剂治疗。

1.3免疫组化法检测肺癌组织中的PD-1表达将入选患者的石蜡组织标本切片、依次脱蜡、脱水后，进行抗原修复；采用体积分数3%过氧化氢室温孵育10 min以灭活过氧化氢酶，PBS洗3次，5 min/次，向切片滴加封闭液，湿盒中室温孵育1 h；滴加PD-1兔源单克隆抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，使用时按1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜。次日取出湿盒室温放置1 h，PBS洗4次，5 min/次；滴加生物素标记的羊抗兔二抗(按1∶200稀释)，湿盒室温孵育15 min，然后用PBS洗3次，5 min/次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，记录显色时间，保证后续样品显色时间一致。苏木精复染细胞核，水化，滴加中性树胶封片。显微镜观察，拍照记录。

由我院两位高年资病理医师分别判读免疫组化结果：在400倍镜下观察，每个标本选取5个视野，每个视野约100个癌细胞。以细胞膜出现棕色颗粒作为阳性细胞，0为不表达，1为弱染色，2为中等强度染色，3为强染色；同时，以PD-1阳性细胞占计数细胞百分比计算分值，<10%、10%～、25%～、50%～、>75%分别计为0、1、2、3、4分。两项指标乘积结果：0为阴性，1～4为“低表达”，5～8为“中表达”，9～12为“高表达”。

1.4随访采用门诊随访和电话随访相结合的方式，获取患者生存资料。随访开始时间为确诊时间，终点为患者死亡或随访截止时间，随访截止时间为2019年9月30日；失访患者9例。

1.5统计学处理采用SPSS 22.0进行数据分析，应用Fisher精确概率法分析肿瘤患者PD-1表达情况与临床病理参数的关系；采用Kaplan-Meier法进行生存分析，并行Log-rank检验；利用Cox比例风险回归模型进行预后影响因素的多因素分析；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1PD-1在NSCLC肿瘤细胞表面的表达见图1。免疫组化结果显示，PD-1蛋白主要定位在肿瘤细胞细胞膜，呈浅黄色至棕黄色颗粒。

A：PD-1阴性组；B：PD-1低表达组；C：PD-1中表达组；D： PD-1高表达组

2.2肺癌组织PD-1的表达和临床病理参数的关系见表1。由表1可知，肺癌组织PD-1的表达与患者年龄、性别、病理类型及肿瘤大小无关(P>0.05)，与TNM分期(P=0.024)及淋巴结转移有关(P=0.004)。

表1 肺癌组织PD-1表达与患者临床病理参数的关系 例

2.3NSCLC组织PD-1表达与患者预后的关系结果见图2，PD-1阴性组与PD-1低表达组、中表达组、高表达组患者生存曲线差异有统计学意义(χ2=19.503,P<0.001)。PD-1阴性组中位生存期(28.7个月)长于PD-1低表达组(15.1个月)、中表达组(10.9个月)、高表达组(14.5个月)。Cox回归结果显示，PD-1表达是NSCLC患者不良预后的预测因素，其他因素与NSCLC预后无关(表2)。

图2 不同PD-1表达水平NSCLC患者的生存曲线比较

因素HR95%CIP性别(参照:男)0.9190.553～1.5280.745年龄(参照:≤60岁组)1.2530.747～2.1020.392TNM分期(参照:Ⅰ-Ⅱ期)1.3610.691～2.6800.372肿瘤大小(参照:≤35.7 mm)1.6540.984～2.7800.058淋巴结转移(参照:否)1.4220.801～2.5270.229PD-1表达(参照:阴性) 低表达2.3301.293～4.2010.005 中表达4.3121.905～9.760<0.001 高表达1.8960.695～5.1690.211

3 讨论

研究[4]表明，PD-1可作为一个免疫检查点，通过抑制酪氨酸磷酸酶SHP-2在T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)下游信号通路的去磷酸化反应，从而抑制T 细胞免疫功能。当T 细胞在慢性感染和肿瘤微环境中被抗原反复刺激时，PD-1表达水平升高，诱导T细胞发生表观遗传修饰，转录因子的表达也发生改变，从而导致T细胞分化进入耗竭状态[15]。体外培养条件下，PD-1在不同亚群T细胞表达水平也有所不同，并且PD-1的表达影响T细胞的分化[16]。近年来，有研究[7-9,14]发现PD-1在肿瘤细胞表面表达，并对肿瘤细胞产生一定的影响。早期关于PD-1的研究主要集中在T细胞功能上，这也是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。在此研究中，我们收集了138例NSCLC患者肿瘤组织标本，检测了PD-1的表达，验证了PD-1不仅表达于T细胞，还表达于NSCLC肿瘤细胞表面。之前有文献[7]报道，PD-1被发现表达于黑色素瘤细胞。肿瘤细胞表面PD-1的表达不仅发生在肿瘤发展的过程中，还发生在肿瘤药物治疗的情况下。有文献[10]报道，BRAF和MEK抑制剂联合治疗可促进黑色素瘤细胞PD-1的表达，这提示肿瘤细胞表面PD-1的表达受药物治疗的影响。有研究[8]显示，肿瘤细胞PD-1的表达可促进肿瘤的发生发展；我们的研究发现，PD-1的表达虽然与患者年龄、性别、病理分型无关，但却与NSCLC患者TNM分期及淋巴结的转移有关，这与之前的报道结果相吻合，说明PD-1的表达可能促进了NSCLC的侵袭和转移。虽然有个案[14]报道NSCLC患者肿瘤细胞表面表达PD-1，但他们的样本过少，研究范围小，且尚未报道其表达与临床病理参数的关系。在本研究中，我们以138例NSCLC标本为研究对象，不仅揭示了PD-1在NSCLC的表达模式，而且分析了其表达与NSCLC患者临床病理参数及预后的关系，揭示了NSCLC患者肿瘤细胞PD-1表达的临床意义，这对后续研究PD-1在NSCLC中的表达具有重要指导意义。

综上所述，我们的研究发现，PD-1在NSCLC肿瘤细胞表面的表达与TNM分期及淋巴结转移有关，是NSCLC患者不良预后的预测因素；PD-1在NSCLC肿瘤细胞的表达是否通过调控肿瘤细胞的生物学行为从而促进淋巴结转移还需要进一步研究证实。