河南汉族人群21个常染色体短串联重复序列基因座的遗传多态性检测

康 冰,王 鑫，吴 东，王红丹，何 淼，苏俊祥，张 波，刘俢铭，廖世秀

1)河南省人民医院河南省医学遗传研究所 郑州450003 2)河南省遗传性疾病功能基因组重点实验室 郑州450003 3)国家卫生健康委出生缺陷预防重点实验室 郑州450003 4)郑州大学人民医院医学遗传研究所 郑州450003 5)河南大学人民医院医学遗传研究所 郑州450003

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称微卫星DNA，是一种可遗传的不稳定的并且具有高度多态性的短的核苷酸重复序列，符合孟德尔遗传定律,在法医学亲子鉴定、个体识别及遗传病连锁分析等方面有广泛应用[1]。目前法医学中最常用的复合扩增体系均包括了13个DNA联合索引系统(combined of DNA index system,CODIS)STR基因座，能够满足一般法医物证鉴定的要求，但在单亲鉴定以及突变等疑难案例中往往需要检测更多STR基因座才能得出最终结果[2-7]。本研究对河南汉族人群20个非CODIS和1个CODIS STR基因座等位基因频率、最小等位基因频率(minimum allele frequency,MAF)、观察杂合度(observed heterozygosity,Hob)、期望杂合度(expected heterozygosity,Hex)、个体识别率(power of discrimination,PD)、多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)、典型父权指数(typical paternity index,TPI)、非父排除率(power of exclusion,PE)及匹配概率(matching probability,MP)等指标进行分析，为亲权鉴定和个体识别提供新的基因座[8]。

1 材料与方法

1.1样本采集按照知情同意和知情选择原则，采集304例河南地区无关汉族人群样本(男154例，女150例)，且三代以内均为汉族，并世代居住于河南。采集静脉血2 mL，EDTA抗凝，-20 ℃保存备用。

1.2主要仪器和试剂ABI 9700型基因扩增仪、3500Dx型DNA测序仪(美国Life公司)、Lab-Aid 820型核酸提取仪(厦门致善生物科技股份有限公司)、GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统22NC试剂盒(中国基点认知技术有限公司)、Chelex-100(美国Sigma公司)。

1.3基因组DNA提取采用Chelex-100方法。取200 μL EDTA抗凝血，加入1 mL ddH2O,混匀，室温置30 min，间歇振荡， 12 000 r/min离心3 min，去上清，加入200 μL 体积分数5% Chelex-100和5 μL 20 g/L的蛋白酶K，56 ℃孵育30 min，振荡后沸水浴8 min，振荡后12 000 r/min离心3 min，4 ℃保存。

1.4STR基因座的复合扩增①参照GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统22NC试剂盒说明操作。扩增体系：去离子水4 μL，5×PCR预混液2 μL，5×22NC引物2 μL，模板DNA(0.25～0.50 μg/L)1 μL，10×增强剂1 μL，总体积10 μL。在ABI 9700型基因扩增仪上扩增：95 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，30个周期；60 ℃ 10 min；15 ℃保存。②PowerPlex®21体系(美国普洛麦格生物技术有限公司)中21个STR基因座的复合扩增参照试剂盒说明进行操作。扩增体系：去离子水5 μL，5×PCR预混液2 μL，5×PP21引物2 μL，模板DNA(0.25～0.50 μg/L)1 μL，总体积10 μL。扩增条件：96 ℃ 1 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30 个周期；60 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.5扩增产物的毛细管电泳分离及检测用3500Dx型DNA测序仪对PCR扩增产物进行毛细管电泳检测，应用Genemapper ID-X软件与ORG-500内标进行比对。片段大小的测定和记录均以±0.5 bp为标准。

1.6GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统22NC体系的效能验证选取21例亲权指数<10 000的二联体和存在突变位点的亲权鉴定计算增加22NC体系后的累计亲权指数(CPI)。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0进行数据分析，采用χ2检验判断各STR基因座的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，检验水准α=0.05。采用PowerStatsV12计算21个基因座的等位基因频率、MAF、Hob、Hex、PD、PIC、PE、TPI、MP。

2 结果

304例河南地区汉族无亲缘关系的无关个体的21个常染色体STR基因座等位基因频率分布见表1。联合利用PowerPlex®21 系统荧光标记试剂盒和GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统22NC体系对21例二联体和存在突变位点的亲权鉴定进行检测，依据规范要求，CPI>10 000，均能得出支持生物学亲子关系的结论(表2)。

表1 河南省地区汉族人群中21个常染色体STR基因座的等位基因频率和遗传学参数(n=304)

续表1

表2 GoldeneyeTM DNA身份鉴定系统22NC体系在21例二联体鉴定中的效能分析

3 讨论

《亲权鉴定技术规范》(GB/T 37223-2018)中提及：对于亲权鉴定过程中，根据检验结果和亲权指数计算结果形成鉴定意见时，在CPI不能满足判定标准时，应增加检测遗传标记。目前法医学领域中常用的复合扩增体系通常能够满足常规法医物证鉴定(如标准亲权鉴定)的要求，但在单亲鉴定以及突变[9]等疑难案例中往往需要增加检测更多STR基因座才能得出最终结果。在本研究21例单亲鉴定案例中，单独使用PowerPlex®21系统荧光标记试剂盒检测时CPI值均小于10 000，不能得出明确结论，在增加GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统22NC基因座后，即使在部分案例(如案例11)出现2个STR基因座突变的情况下，21例单亲鉴定案例CPI均大于10 000，能够得出支持存在生物学亲子关系结论。

本研究是利用GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统22NC，通过抽样研究河南汉族人群，结果表明此体系中所用到的21个常染色体STR基因座多数在河南汉族人群中具有高度多态性[10-11]，GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统22NC可以应用在法医学个体识别与亲子鉴定的日常工作和检测中。GoldeneyeTMDNA身份鉴定系统22NC中的基因座大多数不是常用基因座，在一些特殊个体识别和亲子鉴定中是一个很好的补充。