槲皮素对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

傅 浩，尚静雯，李 敏

1)周口市中心医院男性病科 河南周口 466000 2)周口市中心医院皮肤科 河南周口 466000 3)河南省人民医院皮肤科 郑州 450003

瘢痕疙瘩是皮肤损伤或伤口愈合过程中过度生长的瘢痕组织,其组织学特点为瘢痕过度形成、成纤维细胞过度增殖和细胞外基质成分过度沉积[1]。目前，有多种方法可治疗瘢痕疙瘩，包括手术、皮质类固醇和放疗等[2]。槲皮素是一种存在于多种植物中的多羟基黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、降血压、抗肿瘤等多种药理活性[3]。研究[4]表明，槲皮素可抑制多种肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。本研究旨在探讨槲皮素对体外人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响，并探讨相关的分子机制，以期为用槲皮素预防和治疗瘢痕疙瘩提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂槲皮素(美国Sigma公司)；胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素(美国HyClone公司)；CCK-8检测试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)；细胞周期检测试剂盒(美国BD公司)；BCA蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；β-actin、CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶标记的IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；细胞裂解液、ECL化学发光试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养、分组和处理将瘢痕疙瘩组织标本(来源于周口市中心医院皮肤科)以PBS洗涤2次，去除表皮、血管和脂肪，将组织剪成约0.5 mm3的小块，置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，加入青、链霉素，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。采用组织贴壁细胞培养法培养成纤维细胞。当原代细胞生长铺满皿底部时，添加PBS，轻轻晃动致组织块脱落，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。取传至第3代处于对数生长期的成纤维细胞接种到96孔板中，接种密度为1×105个/mL，将细胞分为0、10、40 μmol/L槲皮素组，每组3个复孔。槲皮素溶解于DMSO中，使用DMEM培养基稀释至所需浓度。

1.3瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖情况的测定取对数生长期成纤维细胞接种到96孔板中，按1.2的方法分组和处理细胞，分别于0、12、24、36、48 h时向各孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃继续培养1 h，使用酶标仪检测490 nm波长处的光密度(OD)值。实验重复3次。

1.4瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞周期的测定对数生长期的成纤维细胞以1×103个/mL接种到6孔板中，于37 ℃培养，待细胞贴壁生长后按1.2的方法分组和处理，继续培养48 h，用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，使用细胞周期检测试剂盒及流式细胞仪测定细胞周期。实验重复3次。

1.5瘢痕疙瘩成纤维细胞中CDK4、Cyclin D1、STAT3、p-STAT3蛋白表达的Western blot检测0、10和40 μmol/L槲皮素组成纤维细胞培养48 h后收集细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，取等量蛋白加入到上样孔中，行SDS-PAGE电泳，蛋白分离后转至PVDF膜上，在50 g/L脱脂奶粉液中封闭2 h， TBST洗膜3次，加入CDK4、Cyclin D1、STAT3、p-STAT3及内参β-actin一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜孵育， TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000稀释)，室温孵育2 h， TBST洗膜3次后加入ECL化学发光液，使用凝胶成像系统成像并拍照，采用Quantity One软件分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0进行统计分析。采用3×5析因设计的方差分析比较槲皮素浓度、作用时间及交互作用对OD值的影响；不同组间细胞周期，CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达量的比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.13组瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性的比较见表1。由表1可知，槲皮素能够浓度和时间依赖性地抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。

表1 3组瘢痕疙瘩成纤维细胞OD值的比较(n=3)

F槲皮素=32.019，F时间=52.768,F交互=18.771，P均<0.001

2.23组瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞周期的比较见表2。与0 μmol/L槲皮素组比较，10、40 μmol/L槲皮素组G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少；与10 μmol/L槲皮素组比较，40 μmol/L槲皮素组G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少。

表2 3组瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞周期的比较(n=3) %

*：与0 μmol/L槲皮素组比较，P<0.05；#：与10 μmol/L槲皮素组比较，P<0.05

2.33组瘢痕疙瘩成纤维细胞中CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3蛋白表达的比较见图1、2和表3。与0 μmol/L槲皮素组比较，10、40 μmol/L槲皮素组细胞中CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达量降低；与10 μmol/L槲皮素组比较，40 μmol/L槲皮素组细胞中CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3蛋白相对表达量降低。

1～3：分别为0、10、40 μmol/L槲皮素组

1～3：分别为0、10、40 μmol/L槲皮素组

c(槲皮素)/(μmol/L)CDK4Cyclin D1STAT3p-STAT300.32±0.030.58±0.060.66±0.070.42±0.04100.20±0.02*0.40±0.04*0.50±0.05*0.23±0.02*400.08±0.01*#0.14±0.01*#0.34±0.04*#0.09±0.01*#F92.57183.09425.600117.571P<0.001<0.001<0.001<0.001

*：与0 μmol/L槲皮素组比较，P<0.05；#：与10 μmol/L槲皮素组比较，P<0.05

3 讨论

瘢痕疙瘩是由于皮肤伤口愈合后瘢痕组织过度生长而形成的。成纤维细胞异常增殖在瘢痕疙瘩的形成中起重要作用[5]。当人体皮肤受损时，在趋化因子作用下成纤维细胞被激活并增殖，沿受损部位已建立的纤维网络迁移，成纤维细胞的增殖引发胶原蛋白和其他细胞外基质的合成，并诱导伤口收缩[6]。因此，开发新的治疗方法或寻找有效的天然药物抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖能力，对瘢痕疙瘩预防和治疗具有重要意义。槲皮素多以甙的形式存在于许多植物的花、叶、果实中，如芦丁、槲皮甙、金丝桃甙等。先前的研究[7]主要探讨了槲皮素对肿瘤的抑制作用，在瘢痕疙瘩中的研究相对较少。

本研究结果显示，槲皮素能够浓度和时间依赖性地抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，阻滞细胞于G0/G1期，这与以往研究[8]结果相符，说明槲皮素对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及周期进程具有抑制作用。这也通过增殖和细胞周期相关蛋白CDK4和Cyclin D1的表达降低得到了证实。STAT3信号通路参与许多生理活动，包括细胞增殖、迁移、分化、ECM沉积和重塑以及其他信号传导途径的调节[9]。有研究[10]报道了STAT3信号通路在瘢痕疙瘩形成中的重要作用。近期研究[11]发现，槲皮素通过抑制STAT3信号途径诱导原发性积液淋巴瘤细胞凋亡和自噬。本研究结果表明，槲皮素可降低瘢痕疙瘩成纤维细胞中STAT3和p-STAT3蛋白表达水平，提示槲皮素可能通过抑制STAT3信号通路抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。

综上所述，槲皮素可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，这些作用涉及STAT3信号通路。然而，仍需要体内研究和前瞻性临床试验来进一步验证槲皮素的治疗效果。