狼疮性肾炎血清MMP9、IFN-γ与HMGB1、TLR4 mRNA的临床意义

鲁冰 任东升★ 陶雅非 栗明

狼疮性肾炎（Lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）最为常见和严重的并发症，5%～20%患者十年内进展为终末期肾病，病死率较高[1]。LN 常累及心脏，根据相关报道，其发生率为52%～98%，可影响患者预后，且不易诊断[2]。基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，MMP9）定位于染色体20q11.1～13.1，根据申晓莉等[3]研究，其在慢性心力衰竭患者中呈高表达，并能影响患者心功能。干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）是水溶性二聚体细胞因子，与自身免疫类疾病的发生有关[4]。高迁移率族蛋白B1（High mobility group box 1 protein，HMGB1）具有调节基因转录、稳固胞核结构的功能，近年来研究发现HMGB1 亦是一种免疫反应相关因子[5]。Toll 样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）是参与非特异性免疫的一类重要分子，Chen X 等[6]研究指出，TLR 通路在心力衰竭期间能通过自噬作用促进心肌细胞凋亡。本实验探讨LN 外周血中MMP9、IFN-γ、HMGB1、TLR4 的表达意义及与心脏损害相关性，报告如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取2017年8月至2019年7月本院收治的63例LN 患者（LN组）及34例LN 合并心脏损害患者（合并心脏损害组），均符合LN 诊断标准[7]，心脏损害标准根据左心室质量指数（Left ventricular mass index，LVMI）划分，即女性、男性分别＞106、114 g/m2，排除入组前1个月内发生过急性心血管事件患者、先天性心脏病患者、合并恶性肿瘤者、存在感染类疾病者。

1.2 方法

采集肘部静脉血5 mL，分别采用上海康朗生物科技有限公司、深圳市科润达生物工程有限公司酶联免疫吸附法试剂盒检测血清MMP9、IFN-γ水平；采用荧光定量PCR检测HMGB1、TLR4 水平，取适量外周血标本，加入Ficoll 分离液，离心，取中间层悬浮细胞，磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）洗，离心，获得外周血单个核细胞，提取RNA，逆转录，配置反应体系，包括引物、4种dNTP、Taq DNA 聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液共20 μL，HMGB1 上下游引物分别为5′-TGGCAAAGGCTGACAAGGCTC-3′、5′-GGATGCTCGCCTTTGATTTTGG-3′，TLR4 上下游引物分别为5′-ATTCCTGCAGTGGGTCAA GG-3′、5′-ACAATTCCACCTGCTGCC TC-3′，GAPDH 上下游引物分别为5′-CAAATTCAACGGCACAGTCAA-3′、5′-TGGTGAAGACACCAGTAGACT C-3′，基因的表达水平以相对GAPDH 来表示。

1.3 观察指标

①比较两组一般资料。②比较两组外周血中MMP9、IFN-γ、HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA的表达。③根据2003年国际肾脏病学会和肾脏病理学会（ISN/RPS.2003）病理分型[8]划分LN 患者为Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ型，比较不同LN 病理分型患者外周血各指标水平。④分析影响LN 合并心脏损害发生的因素。⑤分析各指标与心脏损害的相关性。⑥分析各指标诊断LN 合并心脏损害的价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行处理数据，计量资料以（）表示、t检验，计数资料用n（%）表示、χ2检验，以Logistic多元回归方程行多因素分析，采用Pearson 进行相关性分析，采用接收者操作特征（ROC）曲线及ROC 下面积（AUC）分析各指标诊断LN 合并心脏损害的价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组性别、年龄、病程、LN 活动性指数、病理分型比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组外周血中各指标表达比较

合并心脏损害组MMP9、IFN-γ、HMGB1mRNA、TLR4mRNA水平均较LN组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 两组临床资料对比（±s）Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups（±s）

表1 两组临床资料对比（±s）Table1 Comparison of clinical data between the 2 groups（±s）

组别LN组合并心脏损害组χ2/t 值P 值n 63 34男/女27/36 12/22 0.525 0.469年龄（岁）（34.89±12.35）（35.05±13.97）0.058 0.954病程（月）（18.06±4.46）（17.91±6.41）0.135 0.893 LN 活动性指数（分）（5.21±1.08）（5.33±1.14）0.512 0.610 ISN/RPS.2003 病理分型Ⅰ5（7.94）1（2.94）1.283 0.733Ⅱ27（42.86）15（44.12）Ⅲ23（36.51）12（35.29）Ⅳ8（12.70）6（17.65）

表2 两组外周血中各指标表达水平的比较（±s）Table2 Comparison of the expression levels of various indicators in peripheral blood between the 2 groups（±s）

表2 两组外周血中各指标表达水平的比较（±s）Table2 Comparison of the expression levels of various indicators in peripheral blood between the 2 groups（±s）

组别LN组合并心脏损害组t 值P 值n 63 34 MMP9（ng/mL）381.92±112.03 458.67±126.14 3.079 0.003 IFN-γ（pg/mL）211.62±65.75 274.40±83.69 4.070＜0.001 HMGB1 mRNA 2.91±0.95 3.89±1.11 4.567＜0.001 TLR4 mRNA 1.36±0.42 1.84±0.56 4.765＜0.001

2.3 比较不同LN 病理分型患者外周血各指标表达水平比较

Ⅲ+Ⅳ型患者MMP9、IFN-γ、HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA水平均较Ⅰ+Ⅱ型高（P＜0.05）。见表3。

表3 比较不同LN 病理分型患者外周血中各指标的表达（±s）Table3 Comparison of the expression of various indexes in peripheral blood of patients with different ln pathological types（±s）

表3 比较不同LN 病理分型患者外周血中各指标的表达（±s）Table3 Comparison of the expression of various indexes in peripheral blood of patients with different ln pathological types（±s）

组别Ⅰ+ⅡⅢ+Ⅳt 值P 值n 48 49 MMP9（ng/mL）380.19±105.27 436.87±128.45 2.374 0.020 IFN-γ（pg/mL）174.97±68.59 291.09±75.42 7.928＜0.001 HMGB1 mRNA 2.71±0.91 3.78±1.07 6.903＜0.001 TLR4 mRNA 1.11±0.46 1.94±0.48 8.692＜0.001

2.4 影响LN 合并心脏损害发生因素的分析

MMP9、IFN-γ、HMGB1、TLR4 是LN 合并心脏损害发生的相关危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响LN 合并心脏损害发生因素的Logistic多元回归方程分析Table4 logistic multiple regression equation analysis of factors affecting ln combined with heart damage

2.5 各指标与心脏损害的相关性分析

MMP9（r=0.259，P=0.010）、IFN-γ（r=0.424，P＜0.001）、HMGB1mRNA（r=0.467，P＜0.001）、TLR4mRNA（r=0.480，P＜0.001）与心脏损害呈正相关。见图1。

2.6 各指标诊断LN 合并心脏损害的价值分析

HMGB1mRNA 诊断LN 合并心脏损害的AUC 大于其他指标，表5。

3 讨论

图1 各指标与心脏损害的相关性图Figure1 correlation chart of each index and heart damage

表5 ROC 分析结果Table5 ROC analysis results

MMP9 可由成纤维细胞、单核细胞、中性粒细胞等分泌，以往关于其在恶性肿瘤领域的研究较多，在LN 及LN 合并心脏损害中的报道较少。Vira H 等[9]研究纳入了150例SLE 患者，发现MMP9 可增加SLE 患病风险，并与SLE 疾病活动指数有关。Ugarte-Berzal E 等[10]研究指出，MMP9 可激活免疫复合物中C1，造成肾脏损伤。Mao YM 等[11]进行的一项meta 分析发现，SLE 患者外周血MMP9 水平高于无SLE 正常人群。提示高MMP9水平与SLE 有关，故可能与LN 亦有关。本研究发现，MMP9 在LN 合并心脏损害组、Ⅲ+Ⅳ型患者中均呈高表达，与LN 发生心脏损害、LN 病理分型有关。曲哲等[12]构建MMP9-siRNA 慢病毒，对急性心肌缺血再灌注大鼠模型进行干预，发现干预后大鼠生存率提高，左室收缩末期内径、左室舒张末期内径、左心室质量指数较模型组减少，提示沉默MMP-9 表达可减轻缺血再灌注损伤和心室重构，改善心室功能，从侧面论证了本研究。LN 本质是一种自身免疫疾病，多种细胞因子、免疫细胞参与了疾病的发生。IFN-γ 是其中主要的细胞因子之一，马松鹤等[13]研究采用降植烷诱导建立SLE 小鼠模型，发现与正常小鼠比较，模型小鼠血清中IFN-γ 水平显著升高，并造成肾组织病理变化。张娜[14]的报道中，采用人参皂苷Rg1 抑制IFN-γ 的产生，发现实验动物Th1/Th2 平衡及病情得到改善。可见高水平IFN-γ 可损伤肾组织，加重病情。根据Wen S 等[15]研究，IFN-γ 在LN 患者外周血、肾脏组织中均呈高表达，与疾病活动度密切相关。本研究发现，IFN-γ 在LN 合并心脏损害组、Ⅲ+Ⅳ型患者中均呈高表达，与LN 发生心脏损害、LN 病理分型有关。运锋等[16]研究指出，IFN-γ 在急性病毒性心肌炎小鼠模型心肌组织中呈高表达，采用苏木乙酸乙酯提取物降低IFN-γ 的表达后，光镜下可见心肌病理形态学得到改善，可见IFN-γ与心肌损伤有关，支持本研究结论。IFN-γ 诊断LN合并心脏损害可为临床诊断LN 合并心脏损害提供参考。

TLR4 主要表达于单核巨噬细胞表面，可介导对病原分子模式及内源性表位的识别，连接天然免疫与获得性免疫，在人体免疫系统中起到重要作用。本研究发现，HMGB1、TLR4 在LN 合并心脏损害组、Ⅲ+Ⅳ型患者中均呈高表达，与LN 发生心脏损害、LN 病理分型有关。Song E 等[17]研究TLR4 可通过激活HMGB1，增加心脏活检样本中炎性体的激活，造成心脏功能障碍，均支持本研究结论。同时诊断LN 合并心脏损害的AUCHMGB1mRNA＞TLR4mRNA，可为临床诊断LN 合并心脏损害提供参考。值得注意的是，由于本研究客观实际病例数较少，可能造成数据存在偏倚，更可靠结果有待后续进一步验证。

综上所述，LN 患者外周血中MMP9、IFN-γ、HMGB1、TLR4 高表达，与病理分型有关，并可作为心脏损害的参考指标。