氧化修饰高密度脂蛋白对大鼠颗粒细胞激素分泌的影响及相关机制

马金平 李红娟 李艳敏

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一种妇科常见的内分泌紊乱疾病，患者主要表现为卵巢多囊样病变、月经失调、不孕及性激素分泌异常等症状[1]。PCOS 的发病机制尚不明确，不同种族、生活习惯及遗传因素均可能刺激PCOS 发生，有研究发现大部分PCOS 患者身体肥胖，并伴发代谢综合征[2]。高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）是一种可转运胆固醇的脂蛋白，但该蛋白在铜离子、过氧化物酶等物质作用下易形成氧化修饰高密度脂蛋白（oxidative high density lipoprotein，Ox-HDL），促使卵巢颗粒细胞的胆固醇堆积，并导致细胞的内质网不能正常修饰蛋白质[3]。有研究通过动物实验发现Ox-HDL 可促使小鼠发生内分泌紊乱，对卵巢发育、性激素分泌产生影响，从而导致雌鼠不孕[4]。由于已有研究发现PCOS 患者的血清Ox-HDL 水平异常上升，Ox-HDL 可能与PCOS 的疾病程度密切相关，探讨Ox-HDL 水平对卵巢内分泌功能的作用对治疗PCOS 有重要价值[5]。目前Ox-HDL 对PCOS 的影响研究较少，本研究分析Ox-HDL 对雌性大鼠卵巢颗粒细胞激素分泌的影响及相关机制，为治疗PCOS 提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及大鼠颗粒细胞制备

30 只6 周龄SPF 级SD 雌性大鼠购自河南省实验动物中心，动物合格证号：SCXK（豫）2005-2001，体重180～220 g，平均体重205±12 g。大鼠自由饮食，室温控制为（24±2）℃，湿度为（55±5）%。大鼠适应性喂养5天后，采用孕激素拮抗剂米非司酮进行PCOS 大鼠造模：用橄榄油溶解米非司酮，调整浓度为20 mg/mL，随机选择25 只雌鼠，每天对大鼠进行1次皮下注射，每次剂量0.2 mL，连续14 d。其余5 只雌鼠正常饲养，作为对照组。PCOS 大鼠标准：①雌鼠未排卵；②阴道涂片发现大鼠阴道有角化细胞。选择造模成功的15 只雌鼠，分为模型组，低剂量组及高剂量组，每组5 只。采用生理盐水溶解Ox-HDL，调整为2种浓度，分别为200 μmol/L，400 μmol/L。对照组及模型组大鼠尾静脉注射注射0.05 mL 生理盐水，连续14天。低剂量组每天尾静脉注射0.05 mL Ox-HDL溶液（200 μmol/L），高剂量组，每天尾静脉注射0.05 mL Ox-HDL 溶液（400 μmol/L），连续14天。经脱颈椎处死大鼠，在无菌超净台取出侧卵巢，移入含预冷PBS 的培养皿中，清洗后刺破卵巢成熟卵泡，收集含有颗粒细胞的卵泡液，经200 目细胞筛滤后，以1 200 rmp/min 转速离心6 min，弃上清后采用DMEM 培养液重悬细胞，密度为5×105/mL，置于37℃、5%CO2条件培养。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM 培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；孕马血清促性腺激素购自上海博升生物科技有限公司；RIPA 裂解液购自上海钰博生物科技有限公司；细胞周期试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；MTT 试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司；ELISA 试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司；流式细胞仪购自德国Partec 公司；酶标仪购自北京普天新桥技术有限公司。

1.3 ELISA 实验检测大鼠血清孕激素和雌激素分泌水平

按照ELISA 试剂盒说明书操作然后在492 nm用酶标仪检测各孔OD 值。

1.4 Ox-HDL 对PCOS 卵巢病理形态学观察

采用4%多聚甲醛固定卵巢样本24 h，经清水清洗后采用梯度酒精脱水，采用苏木精染液进行染色，染色时间控制为4 min 左右，经1%盐酸分化后，通过蒸馏水清洗，直至细胞核变蓝，然后经伊红染液浸润15 min 后经梯度酒精清洗5 min，通过二甲苯透明后进行盖片及封片。

1.5 Hoechest33258 凋亡染色实验

将卵巢颗粒细胞种植于12 孔板中，密度为每孔1×105个，置于37℃、5%CO2条件培养。孵育48 h后，采用甲醇固定细胞5 min，然后每孔加入Hoechest33258 溶液避光6 min，然后采用倒置荧光显微镜观察并拍照。

1.6 RT-PCR检测颗粒细胞凋亡基因以及激素相关基因表达水平

各组颗粒细胞经相应处理24 h 后经TRIzol 裂解液提取总RNA，采用Nanodrop 分光光度法检测RNA 质量，按照反转录方法合成cDNA[6]，按照Prime6.0 软件设计引物，Bcl-2基因引物：上游：5′-CTGCACTGCACGTCTGCAC-3′，下游：5′-CGTCACTGCAGTGCTCA-3′；Bax基因引物：上游：5′-CTGCTCACTCACTGCACTC-3′，下游：5′-TCGACTGCACTCCTAC-3′；FSHR基因引物：上游：5′-CGTGCACTGCATGCCATC-3′，下游：5′-CTAACTGCGTCACTC-3′；StAR基因引物：上游：5′-TCGACTCATCACTGCACTC-3v，下游：5′-CTGACTGCATGCACTGC-3′。通过PCR 方法扩增目的基因[7]，以GAPDH基因为内参，采用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达水平。

1.7 Western blot 检测颗粒细胞凋亡蛋白以及激素相关蛋白水平

各组颗粒细胞经相应处理24 h 后，通过RIPA裂解液提取总蛋白，并采用BCA 法检测蛋白浓度。采用10% SDS-PAGE 电泳分离蛋白[8]，采用湿转法将分离的蛋白电转至PVDF 膜，经含5%脱脂奶粉的封闭液孵育1 h 后，分别加稀释的Bcl-2、StAR、FSHR、StAR 蛋白单抗，4℃摇床过夜后，加入HRP 标记的二抗孵育1.5 h，采用ECL 试剂显影，拍照后采用ImageJ 软件分析目的条带灰度值。

1.8 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件进行数据分析。计量资料均以（）表示。组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ox-HDL 对PCOS 大鼠血清雌激素及孕酮分泌的影响

本研究发现PCOS 大鼠在Ox-HDL 作用后，雌激素及孕酮水平均下降，高剂量组的雌激素及孕酮均显著低于其它各组差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 不同浓度Ox-HDL 对PCOS 大鼠血清雌激素及孕酮分泌的影响Figure1 Effects of different concentrations of Ox-HDL on estrogen and progesterone secretion in rat ovarian granulosa cells

2.2 Ox-HDL 对PCOS 大鼠卵巢组织形态的影响

本研究经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色发现正常大鼠卵巢组织黄体和卵泡数量较多，颗粒细胞排列紧密，卵泡膜细胞层数较少。PCOS 大鼠卵巢体积变大，颗粒细胞排列疏松，PCOS 大鼠给予高剂量Ox-HDL 后，囊肿卵泡进一步增多，颗粒细胞排列较为疏松，大鼠卵巢病理症状有一定加剧。见图2。

图2 不同浓度Ox-HDL 对PCOS 大鼠卵巢形态的影响（HE，×40）Figure2 Effects of different concentrations of Ox-HDL on ovarian morphology in PCOS rats（HE，×40）

2.3 Ox-HDL 对大鼠颗粒细胞凋亡能力的影响

Hoechest33258 凋亡染色检测发现高剂量组细胞凋亡水平显著高于其它各组差异有统计学意义（P＜0.05），提示Ox-HDL 可促进大鼠颗粒细胞的凋亡水平。见图3。

图3 不同浓度Ox-HDL 对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响Figure3 Effects of different concentrations of Ox-HDL on apoptotic level of ovarian granulosa cells in rats

2.4 Ox-HDL 对大鼠颗粒细胞凋亡及激素分泌相关基因的影响

RT-PCR 实验发现发现Ox-HDL 可抑制颗粒细胞Bcl-2、FSHR、StAR基因的mRNA 表达水平（P＜0.05）；Ox-HDL 可促进颗粒细胞Bax基因的mRNA表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

2.5 Ox-HDL 对大鼠颗粒细胞凋亡及激素分泌相关蛋白的影响

Western blotting 实验发现发现Ox-HDL 可抑制颗粒细胞Bcl-2、FSHR、StAR 蛋白表达水平（P＜0.05）；Ox-HDL 可促进颗粒细胞Bax 蛋白表达水平（P＜0.05）。见图5。

图4 不同浓度Ox-HDL 对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及激素分泌相关基因的影响Figure4 Effects of different concentrations of Ox-HDL on apoptosis of ovarian granulosa cells and hormone secretion-related genes in rats

3 讨论

PCOS 是临床发病率较高的妇科疾病，大部分患者糖脂代谢异常，且性激素分泌紊乱[9]。PCOS的发病机制较为复杂，已有研究发现胰岛素抵抗及代偿性高胰岛素血症是诱发PCOS 发生的重要因素[10]。HDL 是一种有重要生理功能的脂蛋白，其中载脂蛋白A-1 是HDL 的主要组成部分，主要参与机体的胆固醇运载、抗氧化及调节内分泌等代谢活动[11]。HDL 在过氧化物酶、超氧化物阴离子等物质作用下易发生氧化修饰，形成大量的Ox-HDL，对颗粒细胞的生理功能产生影响。Kolesarova A 等[12]研究发现PCOS 大鼠体内的Ox-HDL水平显著高于健康大鼠，并与PCOS 的疾病程度密切相关。

图5 不同浓度Ox-HDL 对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及激素分泌相关蛋白的影响Figure5 Effects of different concentrations of Ox-HDL on apoptosis of ovarian granulosa cells and hormone secretion-related proteins in rats

有研究发现Ox-HDL 可以下调猪卵巢颗粒细胞培养液中孕酮的分泌水平，但未阐明Ox-HDL 通过何种途径抑制孕酮的合成[13]。本研究结果说明Ox-HDL 不仅可导致大鼠卵巢病理症状加剧，同时激活细胞内的凋亡机制，导致巢颗粒细胞数量下降。PCOS 的病理发生机制较为复杂，有研究仅以卵巢颗粒细胞为研究模型分析Ox-HDL 对细胞激素分泌的影响，不足以充分说明Ox-HDL 对PCOS 的作用效果[14]。有研究发现PCOS 患者血清雌激素及孕酮水平与体内的Ox-HDL 水平有一定相关性[15]。本研究通过Western Blotting 实验证实Ox-HDL 可诱发颗粒细胞发生凋亡。这表明Ox-HDL 可能通过促进颗粒细胞凋亡减少血清雌激素及孕酮水平，由于动物实验中Ox-HDL 通过静脉注射进入大鼠血液系统，并不是直接作用于大鼠颗粒细胞，因而需进一步分析Ox-HDL 对颗粒细胞促凋亡的机制。FSHR、StAR是调节颗粒细胞分泌性激素的重要基因，可刺激cAMP/PKA 信号通路激活，从而促进雌激素及孕酮的合成[16]。本研究结果显示Ox-HDL 可抑制颗粒细胞的FSHR、StAR基因的表达，提示Ox-HDL 可有效抑制颗粒细胞的激素合成。

综上所述，Ox-HDL 可PCOS 大鼠卵巢病理症状加剧，促进颗粒细胞凋亡水平上升，并干扰性激素分泌相关基因的表达，从而对卵巢性激素分泌功能产生危害，为临床治疗PCOS 提供实验参考。