阿魏酸抗成骨细胞凋亡作用及其GPR30相关性研究

黄天一，陈婷婷，崔杰，李梦雨，华永庆,3

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023；3.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023)

骨质疏松症(OP)是一种代谢性骨疾病，最终导致骨强度降低和骨折风险增加[1]。随着人口老龄化加剧，OP造成的公共卫生负担日益严重[2]，发现新的治疗药物仍是当前亟待解决的问题。成骨细胞介导的骨形成，在维持骨稳态中起到关键作用[3-4]。在OP形成过程中，机体内环境改变导致氧化应激(OS)水平增加，使得成骨细胞凋亡增加，骨稳态平衡被打破。因而，降低机体OS水平，抗成骨细胞凋亡对维持骨稳态具有重要意义。阿魏酸(FA)是一种酚酸类成分，是抗OP常用中药当归、川芎的有效成分之一。FA被证实具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种生物活性[5]。近来研究发现FA可以预防卵巢切除大鼠的骨质流失[6]。当阿魏酸直接作用于成骨细胞时,可促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖，显著性增加ALP活性和钙化结节的数量[7]，但对其作用机制尚缺乏深入研究。OP的发生与雌激素受体(ER)信号通路密切相关[8]。新型膜雌激素受体G蛋白偶联受体GPR30因其可介导雌激素的非基因组效应，避免ER经典途径的不良反应而受到关注，其在骨代谢疾病中的调控作用也不断得到证明[9]。中药抗OP活性成分槲皮素可以通过GPR30抑制破骨细胞的分化[10]，樱黄素选择性结合GPR30活化MAPK信号通路，促进成骨细胞增殖分化[11]。FA抗成骨细胞凋亡、清除活性氧(ROS)的作用是否与GPR30相关仍不清楚。本实验旨在研究FA对成骨细胞凋亡的影响，并探讨其与GPR30相关的作用机制，为进一步发现OP治疗药物奠定基础。

1 材料

1.1 药品与试剂

MC3T3-E1细胞购自中国科学院上海细胞库，品系：小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14；FITC AnnexinV Apoptosis Detection Kit Ⅰ(批号:8072965)购自BD Pharmingen;Bcl-2(批号:00062312)、β-tubulin兔单克隆抗体(批号:00056545)、FoxO3a兔单克隆抗体(批号:00055690)均购自Proteintech公司；G15(批号：3678/10)购自TOCRIS公司；过氧化氢(H2O2)购自南京宁试化学试剂有限公司；胎牛血清(批号：1715753)、α-MEM培养基(批号：1867733)购自GBICO公司；青霉素-链霉素(批号：L40523)购自北京全式金生物科技有限公司；FA(货号：B20007)购自上海源叶生物科技有限公司；ROS检测试剂盒(货号：S0033)购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 实验仪器

Synergy2型多功能酶标仪(Bio-Tek，美国);C6流式细胞仪(BD Accuri，美国);Chemi Doc TMXRS+数字化凝胶成像工作站(BIO-RAD，美国);SPX-150型生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司);M205FA型体式荧光显微镜(Leica，德国);MCO-20AIC CO2细胞培养箱(三洋，日本);Observer Z1活细胞成像分析系统(Zeiss，德国)。

2 方法

2.1 细胞培养

MC3T3-E1细胞用含10%FBS和1%青霉素-链霉素的α-MEM完全培养基在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行培养。当细胞长至密度85%左右，用含0.25%EDTA的胰酶消化，终止消化后，1 000 r/min条件下离心3 min，进行传代，培养过程中每2～3 d更换培养基。

2.2 MTT检测细胞活力

2.2.1 FA对MC3T3-E1细胞活力的影响 取处于对数生长期的细胞，消化，以每孔5 000个种于96孔板中，分为对照组,1、10、25、50、100、200、400 μmol/L FA组，每孔加入100 μL培养基孵育24 h，待细胞贴壁后对照组加入含0.1%DMSO的完全培养基，其余组加入相应浓度含药培养基继续孵育24 h，吸尽上清液，避光每孔加入200 μL单培和20 μL 5 mg/mL MTT溶液，4 h后吸尽上清，每孔换成150 μL DMSO溶液吹匀，并在490 nm处检测吸光度值。

2.2.2 FA对H2O2诱导后的细胞活力的影响 细胞种植密度为每孔104个，分为对照组，H2O2组,0.1、1、10、25、50、100、200、400 μmol/L FA组，每孔加入100 μL培养基孵育24 h。除对照组外，每组换成含400 μmol/L H2O2的培养基，4 h后换成相应浓度含药培养基，重复上述操作。

2.3 流式及荧光图片采集

MC3T3-E1细胞种于60 mm×15 mm培养皿中，分为对照组、H2O2组和给药组，待细胞密度为60%左右时，加入400 μmol/L H2O2诱导细胞损伤，4 h后换成含药培养基。24 h后对细胞进行以下处理。

2.3.1 细胞凋亡检测 用800 μL不含EDTA的胰酶消化4 min，同体积完全培养基终止消化后，用1 mL D-hanks清洗细胞，1 000 r/min条件下离心3 min，弃去上清液，按照Annexin∶PI∶结合液=25∶25∶500的条件对细胞进行染色，常温孵育20 min后即可上机处理。

2.3.2 ROS流式检测 采用含0.25%EDTA的胰酶消化30 s，终止消化后用D-hanks清洗细胞，1 000 r/min条件下离心3 min，弃去上清液，加入DCFH-DA∶D-hanks=1∶1 000的工作液进行染色，37 ℃孵育30 min后，D-hanks清洗细胞2遍，并最终加入400 μL D-hanks上机处理。

2.3.3 ROS荧光采集 用D-hanks对皿内进行清洗，加入DCFA-DA∶D-hanks=1∶1 000的工作液进行染色，37 ℃孵育30 min后，D-hanks清洗细胞，在波长488 nm下活细胞成像进行图像采集。

2.4 Western blot分析

MC3T3-E1细胞以每孔3×105个种于6孔板中，分为对照组、H2O2组和给药组，待细胞密度为60%左右时，加入400 μmol/L H2O2诱导细胞损伤，4 h后换成含药培养基。24 h后将细胞按照BCA法蛋白提取试剂盒说明书进行处理。Western blot法在恒流40 mA的条件下电泳90 min，恒压100 V的条件下转膜90 min，5%BSA封闭1 h，一抗过夜，再孵育1 h二抗。检测Bcl-2的表达，并选取β-tubulin作为内参。

2.5 免疫荧光检测

MC3T3-E1细胞以每孔4×104个种于放有玻片的12孔板中，分为对照组、H2O2组、FA给药组和G15拮抗剂组，待细胞密度为60%左右时，加入400 μmol/L H2O2诱导细胞损伤，4 h后换成含药培养基(对照组、H2O2组为完全培养基，给药组为含50 μmol/L FA的完全培养基，抑制剂组为含50 μmol/L FA和100 nmol/L G15的完全培养基)。24 h后将玻片取出置于干净的12孔板中，PBS洗涤附着的培养基，甲醇固定后用2%Triton破膜15 min，1.5%BSA封闭后一抗过夜，第2天回收一抗，IgG-FITC避光孵育1 h后PBS清洗，采用DAPI对细胞核进行染色，PBS洗涤残余染液后在激发波长488、370 nm条件下用活细胞工作站进行图像采集，并用Image J软件进行数据分析。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 FA对H2O2诱导后MC3T3-E1细胞活力的影响

在正常状态下，与对照组相比，不同浓度(1、10、25、50、100、200、400 μmol/L)FA对MC3T3-E1细胞活力并无显著影响(图1)。在过氧化损伤状态下，与对照组相比，H2O2组细胞活力明显降低(P<0.05)，25、50、100、200和400 μmol/L FA组细胞活力较H2O2组显著升高(P<0.05～0.01)(图2)，且100 μmol/L FA组升高趋势最为明显。

3.2 FA对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞凋亡率的影响

结果发现H2O2能造成MC3T3-E1细胞凋亡率增加，而FA干预后，较H2O2组显著降低(图3)。Western blot结果表明，与H2O2组相比，10、25、50、100 μmol/L FA均能不同程度地促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.05～0.01)(图4)。结果表明25、50、100 μmol/L FA具有较为稳定的抗MC3T3-E1细胞凋亡能力。

3.3 FA对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞ROS的影响

流式结果显示，与对照组相比，H2O2组ROS水平明显升高，25、50 μmol/L FA干预后MC3T3-E1细胞内ROS含量明显下降(图5)。活性氧荧光图像采集数据分析结果表明不同浓度FA能显著清除细胞内H2O2刺激下异常升高的ROS(P<0.05～0.01)，且25、50 μmol/L FA效果较为显著(图6)，为了实验结果更为稳定，采用50 μmol/L FA进行后续实验。

3.4 GPR30对FA抗凋亡和抗氧化作用的影响

流式结果表明，GPR30特异性抑制剂G15单用对MC3T3-E1细胞凋亡并无明显影响(图7A)，FA组较H2O2组细胞凋亡率显著降低，100 nmol/L G15组细胞凋亡率较FA组明显升高(图7B)(P<0.01)，这表明G15对FA抗凋亡能力有抑制作用。ROS流式结果显示，G15组较FA组细胞内ROS水平明显升高(P<0.01)(图8)，与荧光采集结果所呈现的相同(图9)，说明G15对FA抗OS能力有抑制作用。提示GPR30可能是FA发挥抗氧化和抗凋亡作用的关键影响因子。

3.5 GPR30干预FA对OS状态下FoxO3a的核易位的影响

免疫荧光结果显示，H2O2组FoxO3a在细胞核内的含量较对照组增加，50 μmol/L FA干预后FoxO3a在细胞核内含量较H2O2组明显减少(图10)，说明FA可以阻止过氧化损伤后FoxO3a的核易位；给予100 nmol/L G15之后，相较于50 μmol/L FA组FoxO3a的核易位明显增多，说明在G15作用下FA阻碍FoxO3a核易位的能力明显降低。表明FA可能通过GPR30影响FoxO3a的核易位。

4 讨论

骨稳态依赖于骨形成和骨吸收之间的动态平衡，当骨形成速率低于骨吸收速率时可引发OP。在OP患者中，女性发病率远高于男性[12]，这可能与女性绝经后雌激素骤降有关。雌激素缺乏会降低机体对OS的防御能力并加速骨骼的衰老[13]。OS是由ROS过量引起的氧化还原失衡，研究表明，细胞中ROS水平升高会通过各种分子级联激活Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的表达，最终介导细胞凋亡[14]。在成骨细胞中，OS通过抑制成骨细胞前体细胞成熟，降低成骨细胞分化率，并诱导其凋亡[15]。可见，雌激素缺乏引起的OS是骨形成抑制的关键影响因素。

雌激素是具有广泛生物活性的类固醇激素。传统认为，雌激素通过其受体ERα和ERβ介导下游信号通路发挥抗OP作用[16]，但是该途径的激活会导致乳腺癌和子宫内膜增生等副作用[17]。近年来研究发现位于细胞膜上的雌激素受体亚型GPR30具有重要的骨保护作用[18]。GPR30敲除后大鼠骨骼生长被显著抑制[19]，GPR30特异性激动剂G1可以增加大鼠骨密度，并可避免雌二醇引起的子宫上皮细胞增殖[20]，子宫质量增加[21]。不同于传统的ERα和ERβ，GPR30主要位于细胞膜上，通过非基因组效应快速激活细胞内的第二信号系统，激活PI3K/Akt、MAPK等信号通路并引起下游反应[22]，而非通过传统认识的雌激素效应元件发挥作用。这提示，通过特异性激活GPR30途径可能可以避免传统雌激素替代疗法因激活ERα引起的子宫内膜增生等副作用。而中药中广泛存在着与GPR30通路相关的活性成分[23-25]。这些研究表明GPR30可能是中药活性成分干预成骨细胞存活和凋亡的重要调控因子。

在前成骨细胞中，FoxO3通过调控Wnt/β-catenin信号通路，在增殖、分化成熟和骨基质矿化等方面扮演着十分重要的角色。有研究证实，ROS积累后，FoxOs易位至细胞核，与TCF竞争性结合β-catenin，最终减少成骨细胞的增殖与分化[26]。GPR30对OS具有重要的调控作用[27]。雌激素通过GPR30介导FoxO3的失活[28]。最新研究表明，FoxO3进入细胞核后，可下调抗凋亡基因Bcl-2的表达，并上调促凋亡基因Bim的表达，最终引起细胞凋亡[29-30]。本研究表明FA可通过GPR30干预OS状态下的FoxO3a核易位，进而发挥抗凋亡作用。

综上所述，FA具有抗成骨细胞凋亡和降低ROS水平的作用，并可阻碍过氧化损伤后FoxO3a的核易位，其机制可能与GPR30有关。本研究提出FA可能通过激活GPR30抗成骨细胞凋亡，这提示其可能在治疗OP中发挥作用。本研究为阐明中药活性成分抗骨质疏松作用机制提供新的思路，为临床寻找新的OP治疗药物奠定了基础。