荧光光谱法研究苯乙醇胺A与CdTe纳米材料的相互作用

熊 艳，徐 俊，邱素艳, 魏益华，张金艳*

1. 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，江西 南昌 330200 2. 农业农村部农产品畜禽产品质量安全风险评估实验室(南昌)，江西 南昌 330200

引 言

苯乙醇胺A属于β-受体激动剂，又称为克伦巴胺，克仑巴胺，学名为2-4-(4-硝基苯基)丁基-2-羟基氨基-1-甲氧基苯乙醇，是一种人工合成的化学物质。2010年9月四川省广安市广安区枣山镇畜牧兽医站对某养猪场例行违禁药物监测中，用莱克多巴胺测试卡分别检测母猪、仔猪和育肥猪尿液，发现该场育肥猪尿检呈阳性，之后确认是新型添加物苯乙醇胺A。同时也在破获的瘦肉精事件中，发现饲料中检测出以前从未出现过的苯乙醇胺A。苯乙醇胺与其他瘦肉精品种如莱克多巴胺等相比，同样可使动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移，显著提高胴体瘦肉率和饲料报酬[1-3]。但是，β-受体激动剂易在动物组织，特别是内脏中蓄积残留，其通过食物链进入人体后可引发肌肉震颤、心律失常、头痛等症状，严重者可能危及生命[4-5]。鉴于以上原因，中华人民共和国1519号公告规定，禁止在饲料和动物饮水中使用苯乙醇胺A等物质[6]。欧盟已于1996年禁止在畜牧生产中使用该类药(ECDirective 96/22/EC)。但是，目前仍有养殖者将其违法使用在畜牧业中，引发药物残留，从而对消费者健康造成严重损害。

目前的检测分析方法有液相色谱串联质谱法[7]、气相色谱串联质谱法[8]、ELISA法[9]、免疫法[10]等。以上分析方法都分别存在样品前处理过程复杂、需要进行衍生化，分析时间过长，涉及使用大型精密仪器设备等缺点，无法满足现场检验检测需求。而胶体金试纸法存在灵敏度过低等缺陷。因此迫于开发一种无需复杂的前处理过程，无需昂贵精密的仪器设备，在普通的实验室就能够开展的分析方法，鉴于该类药物的监测最常采集的活体样本是尿液，基层监督检测中也多以尿液为样本进行速测筛选。因此，建立健全对此类药物快速并行之有效的检测方法是十分重要和必要的，这将对基层执法监测提供快速、准确、有效的技术支撑，来满足农产品质量安全日常监督监管的需要。

量子点作为现代科技的研究前沿，具有荧光产率高、光稳定性强、荧光寿命长、生物相容性好、激发波长范围宽等优点，与生物学、免疫学等结合运用到现有检测方法中成为农产品质量安全研究领域的发展趋势[11-13]。在目前已报道的应用研究中，量子点已成功的应用部分β-受体激动剂的检测分析中，如沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺，但应用到苯乙醇胺A的检测还并不多见。基于此，本文以简化样品前处理过程，在一定浓度的CdTe溶液里，苯乙醇胺A能够使体系的荧光强度增强，并呈现良好的线性关系，因此建立一种检测猪尿中的苯乙醇胺A的荧光增敏方法。

1 实验部分

1.1 设备与试剂

F-7000型荧光分光光度计(日立公司)； U3900型紫外可见分光光度计(日立公司)； pHS-3C酸度计(上海雷磁公司)； 波消解仪(美国CEM公司)。

碲粉(Te99.999%，中国医药集团上海化学试剂公司)； 氯化镉(CdCl2·2.5H2O，国药集团化学试剂有限公司)； 硼氢化钠(96%，中国医药集团上海化学试剂公司)； 氢氧化钠(分析纯，中国医药上海化学试剂公司)； 罗丹明6G(分析纯，上海纪宁实业有限公司)，克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、特布他林、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗、西马特罗、非诺特罗标准品，巯基丙酸等均购自Sigma-Aldrich公司； 实验用水由Milli-Q水处理系统(Millipore)制的。

1.2 方法

1.2.1 CdTe纳米材料的制备

具体制备过程参见文献[14]，在此基础上，略作改动，以巯基丙酸作为稳定剂。称取0.07 g CdCl2·2.5H2O溶于190 mL高纯水中，再加入80 μL巯基丙酸，形成悬浊液体系； 用0.1 mol·L-1NaOH溶液调节所述悬浊液体系的pH为11，通高纯氮气30 min，在氮气保护下，加入200 μL NaHTe溶液(通过Te粉与硼氢化钠反应所得)，控制溶液中Cd2+，HTe-，巯基丙酸的摩尔比为1.0∶1.0∶3.0，得CdTe纳米材料前驱体； 将所述CdTe纳米材料前驱体转移至微波消解仪中，功率设定800 W，100 ℃加热10 min，经冷却、洗涤、离心，即得所述CdTe纳米材料。

1.2.2 制作荧光增敏标准曲线

配制一系列不同浓度的苯乙醇胺A标准溶液，并将其分别移至5 mL的比色管中，向每个所述比色管中均加入1.0 mL浓度为7.25×10-4mol·L-1的CdTe溶液，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容，摇匀后，室温放置15 min，用分子荧光光度计检测上述各个体系的荧光强度F； 同时，取1.0 mL浓度为7.25×10-4mol·L-1的CdTe溶液加入到5mL的比色管中，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容，摇匀后室温放置15 min，用分子荧光光度计检测体系的荧光强度F0； 以苯乙醇胺A浓度为横坐标，以F/F0为纵坐标，得苯乙醇胺A对CdTe纳米材料荧光增敏的线性回归方程。

1.2.3 样品的测试

分别取1.0 mL 7.25×10-4mol·L-1的CdTe溶液和含苯乙醇胺A的样品液加入到5 mL的比色管中，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液定容，摇匀使其充分反应，室温放置15 min，用分子荧光光度计检测得到体系的荧光强度，与所述苯乙醇胺A对CdTe纳米材料荧光增敏的线性回归方程对照，即得所述样品液中苯乙醇胺A的含量。

1.2.4 猪尿样品的前处理

取猪尿样品液，用NaOH溶液调节pH为7.0，过滤并将收集滤液，即得。

2 结果与讨论

2.1 CdTe纳米材料的TEM和荧光光谱图

图1和图2是微波合成的CdTe纳米材料的TEM图谱和荧光光谱图。从图中可以看出，微波辐射法合成的CdTe纳米材料大小粒径比较均匀，粒径约为4.5 nm，参照Demas[15]的方法来测试该量子点的量子产率达52.341%。该CdTe纳米材料的最大发射波长为650 nm，半峰宽为45 nm。

图1 CdTe纳米材料的TEM图Fig.1 The TEM of CdTe nanomaterials

图2 CdTe纳米材料的荧光光谱图Fig.2 The fluorescence spectrum of CdTe nanomaterials

2.2 CdTe纳米材料与苯乙醇胺A的相互作用图谱

图3为不同浓度的苯乙醇胺A与CdTe纳米材料的相互作用荧光图谱。从图中可以发现，在CdTe纳米材料体系里，当加入8，16，32，40，60，80和120 μg·L-1不同浓度的苯乙醇胺A溶液，体系的荧光强度出现了有规律的增强，而且体系的最大的荧光波长没有变动。以苯乙醇胺A浓度为横坐标，以F/F0为纵坐标，得苯乙醇胺A对CdTe纳米材料荧光增敏的线性回归方程见图4，其荧光增敏标准曲线回归方程F/F0=0.001 9c+ 1.032 1，线性相关系数为0.996。不同浓度的苯乙醇胺A能够使CdTe体系的荧光强度增强的可能原因是由于苯乙醇胺A能够有效的填补CdTe纳米材料的表面缺陷，进而增强了体系的荧光强度。

图3 CdTe纳米材料与不同浓度苯乙醇胺A的光谱变化图

1—8体系中苯乙醇胺A的浓度分别为0，8，16，32，40，60，80和120 μg·L-1

Fig.3 The spectrum between CdTe nanomaterials and phenylethanolamine A

The concentration of phenylethanolamine A was 0，8，16，32，40，60，80 and 120 μg·L-1respectively

图4 苯乙醇胺A对CdTe纳米材料的荧光增敏标准曲线

Fig.4 Standard curve for fluorescence enhancement of CdTe nanomaterials by Phenylethanolamine A

2.3 影响因子

在体系优化的过程中，固定体系内的苯乙醇胺A的浓度为100 μg·L-1。

2.3.1 缓冲溶液的影响

实验考察了KH2PO4-NaOH，Tris-HCl，KH2PO4-Na2HPO4，Na2HPO4-柠檬酸4种缓冲溶液(相同的pH值，相同的浓度)对体系的ΔF的影响。结果发现了在KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液中，体系的荧光强度相对稳定。本实验将其作为缓冲溶液，当该缓冲溶液的浓度为0.06 mol·L-1时，体系的荧光强度最大。

2.3.2 缓冲溶液pH的影响

在pH值7.2～9.8之间考察了KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液对体系ΔF的影响。结果表明当pH值为7.4时，体系的荧光强度ΔF最大。故本实验选择pH为7.4的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液。

2.3.3 反应时间、反应温度、试剂加入顺序的影响

实验选择不同浓度的苯乙醇胺A溶液与固定浓度的CdTe溶液先混合，用磷酸盐缓冲溶液定容，最佳的反应时间是15 min，最佳的反应温度为20 ℃。

2.3.4 线性范围、精密度、检出限

实验结果表明，体系的荧光强度与苯乙醇胺A在8～120 μg·L-1, 范围内呈良好的线性关系。其回归方程为F/F0=0.001 9c+1.032 1，线性相关系数为0.996，方法检出限为3.5 μg·L-1，相对标准偏差为0.8%(n=6)。

2.3.5 共存物质的影响

2.4 机理探讨

以巯基丙酸作为稳定剂合成CdTe纳米材料，表面具有很多缺陷。在一定的条件下，引入不同浓度苯乙醇胺A，耦合作用链接到表面具有羧基的CdTe量子点表面上，能够有效地弥补CdTe纳米材料的表面缺陷，从而使得体系的荧光强度增强。因此能够基于此原理，建立一种检测分析猪尿中的苯乙醇胺A的荧光增敏方法。

2.5 样本的测定

利用CdTe纳米材料荧光增敏法和液相色谱串联质谱法连用对添加的CLE的猪尿样品进行检测，每个浓度检测6次。结果见表1，该荧光增敏法能够用于猪尿样品中苯乙醇胺A的检定，方法令人满意。

表1 猪尿样品种不同添加浓度的HPLC-MS-MS和荧光增敏法测定结果的比较

Table 1 Comparison of detection results of pork sample by HPLC-MS-MS and Fluorescence enhancing methods

添加水平/(μg·L-1)HPLC-MS-MS测定/(μg·L-1)荧光增敏法测/(μg·L-1)1010±2.310±1.22020±1.620±3.83030±3.130±4.73535±4.235±6.86060±5.260±7.98080±8.980±10.2

3 结 论

以巯基丙酸作为稳定剂，微波辐射合成的CdTe纳米材料性能优良，粒径均匀，约4.5 nm, 荧光强度强，量子产率达52.341%，半峰宽为45 nm。基于苯乙醇胺A在一定的条件下，能够填充CdTe纳米材料的表面缺陷，使得体系的荧光强度增强，从而建立一种检测苯乙醇胺A的荧光增敏方法。苯乙醇胺A在8～120 μg·L-1浓度范围内呈良好的线性关系。其回归方程为F/F0=0.001 9c+1.032 1，线性相关系数为0.996，方法检出限为3.5 μg·L-1，相对标准偏差为0.8%(n=6)，经与高效液相色谱-串联质谱法相比，结果满意。为苯乙醇胺A的检测提供一种分析方法。